头穴丛刺对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力及TH表达的影响

孙远征，许 娜，王雅青

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

慢性脑供血不足是由多种原因引起的长期的脑供血不足导致的脑代谢障碍和功能衰退的一种病理过程，早期表现为一个或多个认知领域功能障碍，最终进展为血管性痴呆(vascular dementia，VD)、动脉硬化性白质脑病(Binswanger病)等多种脑血管疾病[1]。自上个世纪90年代以来关于慢性脑供血不足的病理机制及其治疗的研究日益受到重视，有效干预慢性脑供血不足的进展对于预防上述脑血管疾病的发生有重大意义。而迄今的研究结果表明，现有治疗手段多为针对血管性痴呆，而缺乏对本病理状态的特异性治疗手段[2]。本课题采用于致顺老师的头穴丛刺方法干预慢性脑缺血大鼠，观察对学习记忆能力及相关蛋白表达的影响，为临床干预慢性脑供血不足所致认知功能障碍提供新的思路。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠65只，体重180～230 g，动物及饲料均由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。实验前适应性驯养1周，室温及湿度保持23℃、70%左右。

1.2 药品及试剂

尼莫地平片(天津市中央药业有限公司)，兔抗大鼠TH抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥试剂公司)。

1.3 仪器与设备

Morris水迷宫由安徽淮北正华生物仪器设备有限公司提供;华佗牌针灸针规格:0.30 mm×13 mm。

2 实验方法

2.1 动物分组

65只大鼠中淘汰游泳能力差和智力低下的大鼠3只后，随机分为假手术组10只和手术组52只。术后4周进行第2次Morris水迷宫实验，统计大鼠逃避潜伏期及平台所在象限游泳路程，淘汰超出空白对照组范围的大鼠，剩余2VO手术组27只大鼠，随机分为模型组9只、头针组9只、药物组9只。

2.2 造模方法

采用Sarti等[3]改良的2VO，分次结扎大鼠双侧颈总动脉。大鼠术前12 h禁食，4 h禁水。麻醉方法以大鼠每千克体重300 mg10%水合氯醛，给予腹腔注射。大鼠进入麻醉状态后，将其仰卧位固定，依次于颈前术区去毛，碘伏消毒，手术侧颈部切开约1～2 cm，钝性分离颈总动脉，采用0号线依次结扎颈总动脉近心、远心端，确保结扎牢固后，用眼科剪将颈总动脉从两个结扎点中间剪断，以确保阻断颈总动脉血流，剪断后，局部消毒，逐层缝合。手术过程保证体温及呼吸的稳定。手术后动物置于保温的单笼饲养。1周后采用同法结扎另一侧颈总动脉。术后每日腹腔注射青霉素20万单位/kg，连续7天。假手术组手术方法及术后饲养方法同手术组，但仅分离暴露颈总动脉而不结扎。

各组大鼠予以相同环境、饲料、供水条件饲养4周。

2.3 水迷宫测试

采用英国心理学家Morris于20世纪80年代设计并应用于学习记忆脑研究的水迷宫系统[4]，分别于术前、术后4周、术后8周对各组大鼠进行水迷宫试验。水迷宫试验共4天，前3天定位航行，记录各组每只大鼠逃避潜伏期(s)，即从大鼠入水到找到并爬到平台上的时间，最长时间记为120 s，逃避潜伏期越短，说明大鼠的学习能力越好;第4天空间探索，记录撤出平台后于平台所在象限游泳路程。

2.4 各组处理

假手术组、模型组:不予以任何处理，饲养方法同前。

头针组:术后第5周开始治疗，以头穴丛刺理论为核心，参照《实验动物穴位图谱》取大鼠的百会穴，并取百会左右各旁开2 mm共3个穴位，从后向前平刺6～8 mm，每15 min捻针1次，100转/min左右，每次持续捻转3 min，留针30 min，每日1次，每天同一时段治疗，共治疗4周。

药物组:术后第5周开始，进行尼莫地平灌胃治疗。0.5%羧甲基纤维素钠溶液溶解尼莫地平片，配成尼莫地平浓度为 0.02%的悬浮液，按大鼠体重1 mg/kg灌胃，每天1次，与头针组同一时段进行，连续治疗4周。

2.5 灌注取材

术后8周后，采用Morris水迷宫，定向航行试验与空间探索试验分别检测各组大鼠的学习记忆能力，数据整理后，采用多聚甲醛对各组大鼠进行固定处理，断头取脑，石蜡包埋，切片，分别进行HE染色及免疫组化验查。

2.6 统计分析

所有数据均采用SPSS17.0统计软件包处理，进行方差齐性分析，单样本t检验，数据以±s表示，P＜0.05为具有统计学意义。

3 结果

3.1 行为学结果分析

3.1.1 造模结果 术后4周除假手术组外各组大鼠逃避潜伏期均明显延长，与假手术组相比(P＜0.05)差异具有统计学意义;平台所在象限游泳路程明显缩短，与假手术组相比(P＜0.05)，差异具有统计学意义。说明造模成功。见表1、表2。

表1 术后4周各组大鼠逃避潜伏期比较(±s，s)

表1 术后4周各组大鼠逃避潜伏期比较(±s，s)

注:与假手术组比较，*P ＜0.05。

分组 例数 术后4周假手术组9 9.21 ±2.31模型组 10 20.39 ±4.53*头针组 9 23.21 ±3.89*药物组 9 21.15 ±4.31*

表2 术后4周各组大鼠平台所在象限游泳路程比较(±s，cm)

表2 术后4周各组大鼠平台所在象限游泳路程比较(±s，cm)

注:与假手术组比较，*P ＜0.05。

周路程假手术组分组 例数 术后4 9 1119.85 ±150.04模型组 10 979.88 ±101.20*头针组 9 953.63 ±90.69*药物组 9 876.65 ±77.15*

3.1.2 治疗后行为学结果 ①学习能力方面:头针组和药物组较模型组大鼠逃避潜伏期明显缩短，有明显的统计学意义(P＜0.01);头针组与药物组相比大鼠逃避潜伏期无明显差异，无统计学意义(P＞0.05)。②记忆能力方面:头针组、药物组与模型组比较大鼠原平台所在象限游泳路程明显延长，具有明显的统计学意义(P＜0.01);头针组与药物组比较大鼠原平台所在象限游泳路程无显著差异(P＞0.05)。见表3、表4。

表3 术后8周各组大鼠逃避潜伏期比较(±s，s)

表3 术后8周各组大鼠逃避潜伏期比较(±s，s)

注:与模型组比较，*P ＜0.01;与药物组比较，ΔP ＞0.05。

分组 例数 逃避潜伏期假手术组9 8.04 ±2.72模型组 10 28.47 ±6.19头针组 9 17.53 ±5.02*药物组 9 18.09 ±3.75＊△

表4 术后8周各组大鼠第一象限游泳路程比较(±s，cm)

表4 术后8周各组大鼠第一象限游泳路程比较(±s，cm)

注:与模型组比较，ΔP ＜0.01;与假手术组比较，*P ＜0.05。

分组 例数 术后8周假手术组9 1153.19 ±107.66模型组 10 835.49 ±86.33*头针组 9 988.63 ±105.34Δ药物组 9 978.37 ±99.35Δ

3.2 病理学结果

3.2.1 HE染色结果 假手术组:额叶皮层及海马细胞数目多，排列紧密有序，形态正常，细胞质染色均匀而色浅，核仁清晰。模型组:额叶皮层及海马细胞数目明显减少，排列疏松，形态不规则，细胞周围间隙明显，胞质不均而着色较深，可见空泡形成，核仁固缩显示不清，并见碎片形成。头针组及药物组:额叶皮层及海马细胞数目较多，排列紧密，染色均匀而浅，少见形态不规则、胞质不均、着色较深、核仁欠清晰的固缩细胞。见图1～8。

3.2.2 免疫组化结果 在400倍显微镜下，按显色的比例统计阳性细胞占细胞总数的百分比。以胞浆内粉红色至棕黄色染色为阳性表达。模型组TH的表达较假手术组明显上调(P＜0.05);头针组、药物组TH的表达较模型组明显上调(P＜0.05);头针组与药物组TH的表达无显著差异(P＞0.05)。见表5及图9～16。

表5 术后8周各组大鼠TH阳性细胞数百分比(±s，%)

表5 术后8周各组大鼠TH阳性细胞数百分比(±s，%)

注:与假手术组相比，*P ＜0.05;与模型组相比，＊＊P ＜0.05。

cortex hippocampus假手术组分组 例数9 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型组 10 48.3 ±2.7* 45.8 ±3.1*头针组 9 78.6±5.1＊＊ 81.2±4.7＊＊药物组 9 79.4±3.6＊＊ 74.4±4.3＊＊

图1 假手术组大鼠额叶HE染色

图2 假手术组大鼠海马HE染色400

图3 模型组大鼠额叶HE染色

图4 模型组大鼠海马HE染色400

图5 头针组大鼠额叶HE染色

图6 头针组大鼠海马HE染色400

图7 药物组大鼠额叶HE染色

图8 药物组大鼠海马HE染色400

图9 假手术组大鼠额叶TH表达

图10 假手术组大鼠海马TH表达

图11 模型组大鼠额叶TH表达

图12 模型组大鼠海马TH表达

图13 头针组大鼠额叶TH表达

图14 头针组大鼠海马TH表达

图15 药物组大鼠额叶TH表达

图16 药物组大鼠海马TH表达

4 讨论

学习记忆能力与复杂的神经生理及生物化学机制相关，其中神经递质对于学习记忆的形成和维持具有非常重要的作用。兰光明[5]经过研究发现，多巴胺系统功能紊乱是认知功能障碍发病的重要机制之一。而酪氨酸羟化酶TH主要分布在多巴胺能神经元和去甲肾上腺素能神经元，是哺乳动物体内儿茶酚胺(catecholamines，CA)类神经递质体内生物合成过程中的限速酶。其活性受体内外多重因素影响，有短周期调节与长周期调节两种机制[6]。慢性脑供血不足使大脑处于缺血缺氧的状态而导致神经元变性，通过短周期调节机制即负反馈作用，使TH表达上调。本实验中，头穴丛刺对TH表达的影响可能与长周期调节机制有关。国内外研究表明[7－8]，低氧状态可提高TH mRNA转录速率和TH mRNA的稳定性，增强胞浆蛋白与TH mRNA 3'端未翻译区域的结合，保护mRNA免受核酸酶的作用而降解，从而上调TH的表达，使多巴胺等儿茶酚胺类神经递质合成增多，作为自发性保护学习记忆能力。已有研究[9]表明，钙离子通道阻滞剂尼莫地平有一定的神经保护作用，可以改善认知功能，并已经被有效地运用于临床实践中。

头穴丛刺法是我校于致顺老教授从事针灸事业40余年从临床实践中总结出来的，对中风等各种中枢神经系统疾病有显著疗效，于教授[10]认为，针具刺入后，产生一定的“场”，直接作用干大脑皮层及有关部位，改善了这些部位的病理变化。并经过研究证明，针捻转后能产生运动诱发电位，对相关神经功能的远端部位产生点冲动刺激。近年来关于头穴丛刺治疗范围的研究以及机理的研究也日益增多[11－15]。笔者在本次研究中认识到:①分次结扎双侧颈总动脉术可以成功制作慢性脑缺血大鼠，并且死亡率较低;②头穴丛刺可以明显保护慢性脑缺血大鼠的学习记忆能力，其机制可能与上调TH的表达有关;③头穴丛刺法与尼莫地平治疗慢性脑缺血大鼠的疗效相当，其差异不具有统计学意义。

本实验在众多研究的基础上，采用头穴丛刺方法干预慢性脑缺血模型大鼠，观察其学习记忆能力以及TH表达的变化。经实验可以推论，头穴丛刺确有保护慢性脑缺血大鼠学习记忆能力的作用，其机制可能与上调TH的表达有关。

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