血清储存条件和冻融过程对AQP4抗体测定结果的影响

李海峰 郝洪军 谢琰臣

视神经脊髓炎（NMO）是一种致残性自身免疫疾病。血清水通道蛋白4（AQP4）抗体有助于对NMO与多发性硬化（MS）进行鉴别，这对临床诊治这两种疾病具有重要意义，因为两者的预后以及疗法不同。血清中的AQP4抗体与NMO发病直接有关［1］，且其血清水平与疾病的严重程度相关［2］。临床实践中，只有一些检测中心进行该抗体的检查，其他相关单位需要在常温或冰冻的情况下运输标本到检测中心；临床研究中，标本可能多次被检测，可能经过冻融过程。Jarius等［3］于2011年9月在Clin Chem Lab Med杂志发表论文首次报道储存条件和冻融过程对血清AQP4抗体水平的影响。

该作者采用常规方法从1例NMO患者抽血送检，常温（18℃）下以1800r／min离心8min。将患者的血清标本分成多个小份，同时分别储存在不同条件下（表1）。然后采用英国RSR公司生产的商品化ELISA试剂盒进行双孔检测，其抗原为重组的全长人类AQP4。结果显示AQP4抗体水平在试剂盒标准曲线的范围内（5～160AU／mL）。无论储存温度为－80℃、4℃还是常温，以及冻融次数多少（无冻融、1、2、3或5次冻融），结果均无统计学差异，平均变异系数（CV）为2.66%，提示不同条件下储存标本的ELISA检测结果之间具有高度可重复性。该研究提示至少在8d内于室温或4℃储存或反复冻融对检测结果无影响。但作者提出，该份血清中AQP4抗体水平较高，并不处于正常参考值低限，也不是溶血标本的血清，还需要进一步使用抗体水平较低或溶血标本研究不同储存条件是否会影响所检测到的AQP4水平。该作者同时指出，总体来讲，抗体相对稳定而一些蛋白成分抗原的稳定性较差，如果需要同时检查其他蛋白成分，如细胞因子，则应该储存在－80℃或干冰运输，并避免冻融过程。

Jarius长期从事NMO患者的自身抗体研究，截止2011年9月底在MEDLINE检索可以查到其以第一作者或参与研究的抗体检测文章31篇，涉及AQP4抗体检测方法学建立、AQP4抗体在NMO病谱疾病中的意义、血清和脑脊液中AQP4抗体检测的意义以及多种副肿瘤综合征相关抗体等，且其抗体检测多数采用ELISA方法。基于此，可以确认其具有丰富的ELISA检测经验，所得结果可靠，其平行孔的CV最大者仅为6.61%，也说明其检测时加样的准确性很好。基于准确的检测，以及整体CV很小，可以确认储存条件和反复冻融对AQP4抗体检测结果无影响。

对该研究应予注意:（1）ELISA方法检测蛋白或抗体可能因被测物的不同而使标本处理过程对检测结果的可靠性产生不同影响，最终影响研究的科学性；（2）标本中如果抗体水平过高，可能会超出标准曲线的上限，对于接近上限的检测值，需要考虑稀释标本后重新检测，以确保测出其真实水平，这是ELISA的基本原理决定的；（3）两个平行孔检测的结果按照统计学理论亦可进行标准差和CV运算，但其结果的可靠性相较于通过多个（如6～8个）平行孔结果计算所得结果要差；不过，这个研究总体和各处理组的平行孔结果的变异系数均很小且接近，仍提示其结果具有高度可重复性。

表1 NMO患者血清样本经不同方法处理后其ELISA检测结果

其他以ELISA方法检测的被测物水平受标本处理、储存条件和冻融影响的研究（各研究采用符合各种被测物检测原理的商品化ELISA试剂盒）包括:脑脊液中的磷酸化神经丝重链水平不受反复冻融影响［4］；血清中的麻疹、风疹和水痘病毒抗体水平也不受反复冻融影响［5］；血浆和血清白细胞介素－6水平不受抗凝剂、抽血后延迟处理标本或反复冻融的影响［6］；脑脊液中基质金属蛋白酶－2水平受室温和4℃储存的影响而下降，但不受反复冻融的影响［7］；延迟处理标本、室温储存可以使血管内皮生长因子水平显著增高，但不受－80℃储存2年以及反复冻融的影响［8］；反复冻融使血浆中的von Willebrand因子水平显著下降［9］。可见不同被测物在不同的标本处理、储存和冻融条件下检测到的水平并不都能反映留取标本时被测物的水平。如果考虑到被测物的生物活性，还需要对其活性是否受到上述因素影响进行评价。这样得到的检测值才能更好反映其在体内的水平和活性。

抗AQP4抗体以及前述被测物均为诊断、病情严重程度和疗效监测的生物学标志物。准确检测这些被测物的水平和活性，能够帮助临床决策，也能够更好完成临床科研。尤其是在被测物被转运到检测中心或保存多年后进行临床研究时，研究者不能忽略其标本处理方法和储存方法而简单认为检测值就是该被测物的实际值。确信检测值前要明确检测方法的稳定性和可靠性，同时也要充分考虑到未来研究会将检测的被测物，查阅相关方法学文献，选择适合多种被测物检测的标本处理和储存方法。前述方法学文献多发表在临床检验杂志上，而这也正是临床医生进行研究时容易忽略的，应予注意。

［1］Jarius S，Wildemann B.AQP4antibodies in neuromyelitis optica:diagnostic and pathogenetic relevance［J］.Nat Rev Neurol 2010，6:383－392.

［2］Jarius S，Aboul－Enein F，Waters P，et al.Antibody to aquaporin－4in the long－term course of neuromyelitis optica［J］.Brain，2008，131:3072－3080.

［3 ］Jarius S，Wildemann B.Effect of storage conditions and freeze／thaw cycles on aquaporin－4antibody（NMO－IgG）serum levels［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49:2121－2122.

［4］Petzold A，Keir G，Green AJ，et al.A specific ELISA for measuring neurofilament heavy chain phosphoforms［J］.J Immunol Methods，2003，278:179－190.

［5］Pinsky NA，Huddleston JM，Jacobson RM，et al.Effect of multiple freeze－thaw cycles on detection of measles，mumps，and rubella virus antibodies［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2003，10:19－21.

［6］Knudsen LS，Christensen IJ，Lottenburger T，et al.Pre－analytical and biological variability in circulating interleukin 6in healthy subjects and patients with rheumatoid arthritis［J］.Biomarkers，2008，13:59－78.

［7］Sulik A，Wojtkowska M，Oldak E.Preanalytical factors affecting the stability of matrix metalloproteinase－2concentrations in cerebrospinal fluid［J］.Clin Chim Acta，2008，392:73－75.

［8 ］Hetland ML，Christensen IJ，Lottenburger T，et al.Circulating VEGF as a biological marker in patients with rheumatoid arthritis？Preanalytical and biological variability in healthy persons and in patients［J］.Dis Markers，2008，24:1－10.

［9］Smith BW，Strakova J，King JL，et al.Validated sandwich ELISA for the quantification of von Willebrand factor in rabbit plasma［J］.Biomark Insights，2010，5:119－127.