液相色谱法同步测定化妆品中6种邻苯二甲酸酯

孙文闪，田富饶，杨 委，叶旭炎

(义乌出入境检验检疫局 综合技术服务中心，浙江 义乌 322000)

邻苯二甲酸酯(PAEs)是国际上重点监控的内分泌干扰激素. 这类物质损害人类的生殖系统，影响生物体内激素的正常分泌，导致细胞突变，致畸和致癌[1-2]. 欧盟、美国等已将PAEs列为优先控制的污染物，并不断增加监控种类[3]. 我国也将一些邻苯二甲酸酯列入“中国环境优先污染物黑名单”[4]. 邻苯二甲酸酯在指甲油、头发喷雾剂、香波、洗涤用品、香水等化妆品中广泛使用，而人类与化妆品接触的亲密程度仅次于食品，过多使用含有邻苯二甲酸酯的化妆品，会增加女性患乳腺癌的概率，而且容易引起孕妇流产及胎儿畸形. 因此，化妆品中邻苯二甲酸酯含量的测定对于保护人体健康具有重要作用. 目前，邻苯二甲酸酯的检测方法有气相色谱法[5]、液相色谱法[6]、气质联用法[7]、液质联用法[8]. 作者通过梯度洗脱将6种邻苯二甲酸酯有效的分离，结合DAD光谱进行定性分析，提高了定性分析的准确性，建立了一种快速、灵敏度高、成本较低、准确可靠的检测方法.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent1200型，附带二极管阵列检测器(美国安捷伦公司)；气相色谱-质谱仪：Agilent 6890N-5973GC/MSD(美国安捷伦公司)；超声波清洗器：D-78224型(德国Elma公司)；高速离心机：3-30K型(德国Sigma公司)；分析天平：AL204型，(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；超纯水仪：Milli-Q型(美国密理博公司)；样品滤膜：0.45 μm；甲醇：色谱纯；乙腈：色谱纯；邻苯二甲酸二甲酯(DMP),邻苯二甲酸二乙酯(DEP),邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP),邻苯二甲酸二丁酯(DBP) ,邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP) ,邻苯二甲酸二辛酯(DOP)标准品：纯度为99.8%(上海安普公司)；实验用水为超纯水.

1.2 标准储备液的配制

准确称取邻苯二甲酸二甲酯(DMP),邻苯二甲酸二乙酯(DEP),邻苯二甲酸二丁酯(DBP)，邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP) ,邻苯二甲酸二辛酯(DOP)各100 mg用甲醇溶解后定容至100 mL棕色容量瓶中，配成标准储备液，浓度为1.0 g/L，在4 ℃保存，临用时将标准储备液用甲醇稀释成所需浓度的混合标准工作溶液.

1.3 样品处理

由于邻苯二甲酸类物质无处不在，在实验过程中尽量避免使用塑料材料制成的器皿，所有的玻璃器皿经丙酮清洗后再用色谱甲醇润洗自然风干后使用. 称取化妆品0.500 g，精确到1 mg，用甲醇定容至25 mL，用旋涡振荡器振荡混匀，于超声波清洗仪中超声20 min，对于固体、半固体、黏稠样品，先以10 000 r/min高速离心15 min，上清液经注射器过滤(0.45 μm有机型滤膜)，上机测定，水状的样品直接过滤，然后上机测定.

1.4 色谱条件

液相色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；进样量20 μL，柱温40 ℃；流动相为乙腈-水混合液，流速1.000 mL/min,梯度洗脱程序见表1，后运行时间5 min；检测波长为224 nm. 光谱存储范围190～400 nm.

表1 梯度洗脱程序 Table 1 The process of gradient elution

气相色谱-质谱条件：色谱柱为HP-5MS柱[30 m(长度)×0.25 mm(内径)，0.25 μm(填料颗粒的尺寸)，5% phenyl methyl-siloxane] ；柱温程序：初始温度为50 ℃,保持2 min后以40 ℃/min的速率升至210 ℃，然后以30 ℃/min的速率升至280 ℃，保持10 min；进样口温度280 ℃；色谱-质谱接口温度280 ℃；载气：氦气1 mL/min;电离方式：EI，70 eV;扫描方式：全扫描；进样方式：分流，分流比5∶1,溶剂延迟4.5 min；进样量1 μL.

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

本实验采用甲醇-水和乙腈-水进行等度洗脱、梯度洗脱对6种邻苯二甲酸酯进行分离研究，结果表明：等度洗脱条件下，6种邻苯二甲酸酯不能达到基线分离，梯度洗脱条件下，甲醇-水，乙腈-水都可以将它们进行基线分离，但是与乙腈-水相比，甲醇-水的分离效果较差，并且分离时间长，因此选择乙腈-水作为本实验的流动相进行梯度洗脱.

2.2 检测器的选择

化妆品的成分比较复杂，很多杂质在紫外区都有吸收，会产生很多干扰的色谱峰，如果只从色谱峰的保留时间来定性，可能产生错误的判断，而邻苯二甲酸酯类物质的紫外吸收光谱的特征比较明显，选择二极管阵列检测器，结合保留时间和光谱来进行定性判断，可提高定性分析的准确度. 为了进一步确认光谱定性的可靠性，用GC-MS进行确认. 结果表明，当样品在190～400 nm范围内的光谱与标准物质吻合时，样品的特征离子及其丰度比与标准物质是符合的；相反，当样品的光谱与标准物质的光谱不匹配时，在GC-MS上相应的保留时间没有该物质的色谱峰，或者与标准物质的特征离子不符合. 因此本实验选择二极管阵列检测器进行测定.

2.3 检测波长的选择

6种邻苯二甲酸酯在224 nm和280 nm处都有紫外吸收的峰值，但224 nm条件下的检出限要明显低于280 nm检出限，因此本实验选择224 nm作为检测波长.

2.4 色谱柱的选择

色谱柱是液相色谱进行分离的关键部分，它直接关系到样品分离效果和测定结果的准确性. 为了使6种邻苯二甲酸酯得到很好的分离，本实验用Agilent的Eclipse XDB-C18，Eclipse XDB-C8，300SB-C18，ZORBAX-C8等色谱柱进行试验，结果只有Eclipse XDB-C18在乙腈-水梯度洗脱下，可以将6种目标物质完全分离，并且能够得到较好的色谱峰，在1.4的洗脱条件下，6种目标物与其他的干扰物质也得到了有效的分离，图1、图2、图3分别为标准物质、样品和样品加标的色谱图.

图1 DMP,DEP,BBP,DBP,DEHP和DOP标准物质的色谱图Fig.1 The chromatograms of DMP, DEP, BBP, DBP, DEHP and DOP

图2 样品的色谱图Fig.2 The chromatograms of a sample

图3 加入DMP,DEP,BBP,DBP,DEHP 和 DOP标准物质的色谱图Fig.3 The chromatograms of a sample with addition of DMP, DEP, BBP, DBP,DEHP and DOP

2.5 线性方程和精密度

利用DMP, DEP, BBP, DBP, DEHP, DOP的标准储备液配制成的混合标准工作溶液，浓度依次为20,10，5，2，1 mg/L，按照1.4的洗脱条件进行测定，分别以DMP, DEP, BBP, DBP, DEHP, DOP的浓度(x)对相应的峰面积(y)进行线性回归，线性方程依次为：y=45.8x+0.489,y=40.6x+0.758,y=34.7x+0.182,y=34.1x+6.70，y=24.8x+2.72,y=24.3x+0.305. 相关系数依次为1.000 0，1.000 0，0.999 99，0.999 88，0.999 96，0.999 91. 对DMP, DEP, BBP, DBP, DEHP, DOP浓度为5 mg/L的混合标准溶液连续进样6次，测定结果见表2.

经计算DMP, DEP, BBP, DBP, DEHP, DOP的RSD分别为0.97%，0.64%, 0.11%,0.82%, 1.13%, 0.81%.

表2精密度试验结果

Table 2 Precision experimen mg/L

2.6 回收率和检出限

对6个化妆品样品在2.0 mg/L，5.0 mg/L水平进行加标回收试验，按1.3的洗脱方法进行样品处理，在1.4的洗脱条件下测定，经计算DMP, DEP, BBP, DBP, DEHP, DOP的回收率在90%～98%. 在1.3,1.4的洗脱条件下，以3倍信噪比计算DMP, DEP, BBP, DBP, DEHP, DOP的检出限分别为10.0,4.0,10.0,10.0, 5.0,7.5 mg/kg.

2.7 实际样品测定

在市场随机购买洗手液、身体香露、香水、甲油、指甲油、护发素、洗发水、润肤乳、发用香水等化妆品，用该方法进行测定，结果见表3.

表3化妆品中6种邻苯二甲酸酯测定结果

Table 3 The analytical result of six phthalates in cosmetics μg/g

3 结论

邻苯二甲酸酯作为一类内分泌干扰物，由于其较高的毒性，致畸和致癌作用，在国际上引起了广泛的关注，而化妆品与人类的接触非常密切，建立一种高效、快速、准确、廉价的测定方法对保护消费者免受邻苯二甲酸酯的毒害有重要的作用，本文的研究为化妆品中邻苯二甲酸酯的测定提供了重要的参考依据.

参考文献：

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