肺癌患者RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化检测*

贾要丽，吴拥军，吴秋歌，张 佳，马东波，吴逸明，王 静#

1)郑州大学第一附属医院呼吸与危重症医学科 郑州 450052 2)郑州大学公共卫生学院毒理学教研室 郑州 450001

许多国家肺癌的发病率及病死率呈上升趋势，目前肺癌已成为肿瘤死亡的首要原因。在中国，肺癌的发病率居各类恶性肿瘤之首[1-2]；Ⅰ期肺癌的5 a生存率为60%，但是Ⅱ～Ⅳ期的5 a生存率最多至40%，最低还不到5%[3]。因此，提高肺癌的生存率依赖于肺癌的早期诊断，筛选和挖掘有价值的早期肺癌的生物学标志物成为亟待解决的问题。肿瘤细胞可以释放DNA，使外周血清中含有丰富的DNA[4]，在肺癌患者的血液、支气管肺泡灌洗液、胸腔积液中均可发现易感基因启动子区发生了高甲基化[5]。作者通过实时荧光定量甲基化特异PCR(real-time methylation specific PCR，qMSP)[6]检测肺癌患者和健康对照者外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区的甲基化情况，以期为肺癌的早期诊断提供帮助。

1 对象与方法

1.1研究对象选择2011年4月至2012年4月在郑州大学第一附属医院呼吸内科、胸外科住院的肺癌患者200例。男143例，女57例；年龄26～83(59.6±10.6)岁；组织学类型：鳞癌87例，腺癌72例，小细胞肺癌33例，大细胞肺癌8例；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期55例，Ⅲ、Ⅳ期145例；吸烟者107例，不吸烟者93例；所有患者均经病理学证实，并且排除了其他多种肿瘤的可能。200例正常对照取自同期郑州大学第一附属医院体检科体检正常的人群。男151例，女49例；年龄26～96(53.7±13.4)岁；吸烟者79例，不吸烟者121例；所有正常对照均未发现肺部或者其他器官的恶性肿瘤。抽取2组受试者晨起空腹肘静脉血5 mL，置于-80 ℃保存。

1.2DNA提取和引物设计常规提取外周血基因组DNA，操作步骤严格按照上海莱枫公司全血基因组DNA提取试剂盒说明进行，用紫外分光光度计测量DNA的浓度和纯度，DNA溶液放于-20 ℃冰箱保存待用。RASSF1A和 FHIT基因启动子区的引物序列[7-8]见表1。引物由上海生工生物工程服务有限公司合成。

1. 3DNA甲基化的qMSP检测

1.3.1 DNA亚硫酸氢盐处理 基因组DNA的甲基化修饰应用Intergen CpGenome DNA修饰试剂盒(Qiagen公司)，1 μg 的DNA通过 NaOH变性，再通过亚硫酸氢钠修饰，50 ℃避光水浴过夜，未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，修饰后的DNA通过乙醇沉淀回收并重悬于去离子水中，用于PCR。

1.3.2 PCR扩增 甲基化和非甲基化RASSF1A基因启动子区扩增的 PCR反应体系：2×SYBY qPCR Master Mix(美国Promega公司)10 μL，上下游引物各0.5 μL，亚硫酸氢盐处理后的DNA模板5 μL，补水至20 μL；甲基化和非甲基化FHIT基因启动子区扩增的 PCR反应体系：2×SYBY qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，亚硫酸氢盐处理后的DNA模板4 μL，补水至20 μL。以经过亚硫酸氢盐处理后的胎盘DNA作为未甲基化的阴性对照；以经过甲基转移酶处理后，再经过亚硫酸氢盐处理的胎盘DNA作为甲基化的阳性对照。PCR扩增完成后，通过熔解曲线计算扩增产物的大小，每一个荧光定量PCR循环后会得到一个Ct值，样本甲基化水平用甲基化率表示：甲基化率=1/(1+2)-ΔCt×100%(ΔCt=Ct非甲基化-Ct甲基化)[9]。每个样本均做2个平行样，每次甲基化分析过程中均有2个空白对照。

表1 引物序列

1.4统计学处理采用SPSS 16.0处理数据，连续性变量因数据不符合正态分布所以采用中位数(M)和上、下四分位数(P25、P75)描述。2组外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率，不同临床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率的比较采用Mann-WhitneyU检验，RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率与肺癌危险性的评估采用logistic回归分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率比较见表2。

2.2不同临床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因启动子甲基化率见表3。

表2 2组外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率的比较 %

表3 不同临床病理特征的肺癌患者外周血RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率 %

2.3RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率与肺癌危险性的关系随着RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率增加，患肺癌的危险性增加(表4)。

表4 RASSF1A和FHIT基因甲基化水平与肺癌危险性的logistic回归分析

经过性别、年龄和吸烟水平的调整。

3 讨论

启动子区域 CpG岛基因启动子区甲基化出现在许多恶性肿瘤的发病机制中。外周血中DNA甲基化水平的变化已被证明与包括肺癌在内的多种恶性肿瘤有关[10-12]。研究[10]发现重度吸烟者非肺癌患者中度和重度不典型增生组织中也发现存在FHIT基因的甲基化，提示FHIT基因启动子区甲基化存在肺癌发生的早期。

该研究结果表明肺癌组的RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化率高于正常对照组，提示RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化可能和肺癌的发生相关，这和之前的研究[10]一致；该研究结果表明性别、年龄、吸烟史、肺癌的组织学类型及临床分期对RASSF1A和FHIT基因启动子区的甲基化水平没有影响，与之前的报道[13]一致；也有些研究[14-15]表明年龄、吸烟和组织学类型与RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化改变密切相关，因此，还需要扩大样本进一步探讨。该研究结果同时显示RASSF1A和FHIT基因启动子区的甲基化水平与肺癌的危险性相关，随着基因启动子区甲基化水平的增加，患肺癌的危险性增加，表明RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化是肺癌的危险因素，检测患者外周血RASSF1A和FHIT基因的甲基化水平可能有助于肺癌的危险性预测。

综上所述，RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化和肺癌的早期诊断相关，采用qMSP检测外周血中RASSF1A和FHIT基因启动子区甲基化水平可能有助于肺癌的早期预警。

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