人参二醇组皂苷对血浆血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的影响

韩 冬 朱 凯 刘 苗 代德强 张亚杰 王楚盈 刘 佳 李玉梅 李丽静

(长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

人参二醇组皂苷(PDS)系从五加科人参属植物人参茎叶中提取纯化所得，主要包含人参Rb1，Rb2，Rc，Rd等皂苷单体。已有研究发现，PDS能抗休克、抗心肌梗死、抗缺血再灌注性损伤、降低血糖及改善血脂代谢紊乱〔1～4〕。本课题组前期研究发现，PDS能改善心室重构大鼠心脏血流动力学，减少缩血管物质含量，提高抗氧化能力，提示其对大鼠心梗后心室重构具有保护作用〔5，6〕。本实验拟探讨PDS防治心室重构的作用机制，为其开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 2日龄清洁级Wistar大鼠乳鼠〔合格证号:SCXK-(吉)2007-0003〕，购自吉林大学实验动物中心，用于体外心肌细胞培养。

1.2 药品与试剂 PDS粉末，长春中医药大学天然药物化学研究室提供，白色粉末状，用氯化钠注射液配成所需浓度，经0.22 μm孔径的滤膜过滤除菌后使用。卡托普利片(Captopril)购自中美上海施贵宝制药有限公司;链霉素(大连美罗制药厂)，青霉素(华北制药厂)，胰蛋白酶(Trypsin，Invitrogen，美国)，5'-溴脱氧尿苷(5'-BrdU)(Sigma，美国)，小牛血清(Invitrogen GIBCO，美国)，高糖 DMEM 培养基(Invitrogen GIBCO，美国)，丙酮酸钠(上海生工生物工程公司)，BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.3 主要仪器 荧光倒置显微镜(Nikon，日本)，高压灭菌器(SANYO，日本)，超净工作台(SW-CJ-1F，苏州净化仪器厂)，磁力搅拌器(上海普江分析仪器厂)，电子天平(ALC-10.4，上海精密科学仪器公司)，高速冷冻离心机(Sigma 3K15，德国Sigma公司)，PH测试笔(PH Testr 20，EUTECH，美国)，超速低温离心机(SORVALL，美国)，酶标仪(Bio-Rad，美国伯乐公司)，微量振荡器(MH-Ⅰ，海门市其林贝尔仪器公司)，紫外可见分光光度计(Helios Alpha，美国Unicam公司)，荧光分光光度计(PC150，美国瓦里安公司)，制冰机(SANYO，日本)，二氧化碳培养箱(MCO-18AIC，SANYO，日本)。

1.4 乳鼠心肌细胞的原代培养、分组及处理 心肌细胞原代培养:取2日龄 Wistar大鼠乳鼠心脏，PBS清洗腔室血液，剪去心房、结缔组织，将心室剪碎，1 mm3左右组织块，0.125% 胰酶，37℃ 水浴条件下多次消化，每次约5 min。第1次消化液弃掉，多次消化，被完全消化。以10% 新生牛血清终止消化，离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清，细胞沉淀以 DMEM 培养(20% 新生牛血清液)重悬后接种于培养瓶，二氧化碳孵箱中(37℃、5%CO2)培养90 min，差速贴壁弃去成纤维细胞等其他非心肌细胞，调整细胞浓度，加入5'-BrdU(0.1 mmol/L)，接种到培养板中，二氧化碳孵箱中继续培养。48 h后更换培养液。72 h后，倒置显微镜下见心肌细胞伸出伪足，汇聚成片，现同步自主搏动，随机分为4组，每组6复孔。各组心肌细胞加入相应浓度的PDS或等体积心肌细胞培养液，同时加入 AngⅡ(10－7mol/L)持续作用48 h。实验分组及处理:正常对照组(等体积培养液);肥大模型组:AngⅡ(10－7mol/L);PDS低剂量组:AngⅡ(10－7mol/L)+PDS(400 μg/ml);PDS 高剂量组:AngⅡ(10－7mol/L)+PDS(800 μg/ml)。

1.5 心肌细胞表面积的测定 以每孔1 ml心肌细胞悬液(1×105个/ml)接种于24孔培养板中，经上述分组处理后，用胰酶消化心肌细胞使其脱壁，反复轻柔吹散细胞，静置后照相，利用Leica QWin病理图像分析系统测定心肌细胞表面积，每组检测5个视野，然后取平均值进行比较。

1.6 心肌细胞总蛋白质含量的测定 以每孔2.5 ml心肌细胞悬液(3×105个/ml)接种于6孔培养板，经上述分组处理后，弃除上层培养液，预冷PBS轻柔冲洗，每孔依次加入裂解液，Western及IP细胞裂解液，用移液器吹打，使裂解液与细胞充分接触，裂解后，离心(4℃ 14 000 r/min，5 min)，收集上清，即为细胞总蛋白。应用标准曲线求出各组细胞内蛋白浓度，根据各孔细胞数计算单个细胞总蛋白含量。

1.7 心肌细胞细胞内游离钙离子浓度［Ca2+］i的测定 以每孔2.5 ml细胞悬液(3×105个/ml)接种到6孔培养板中，经上述分组处理后，用胰酶消化心肌细胞使其脱壁，要求细胞浓度达到106个/ml以上，取1 ml放入EP管中。实验组的每管都加入5 μl的Fura-2/AM 储备液，使其终浓度达到5 μmol/L，摇床震动(37℃，60 min)，使Fura-2/AM与细胞充分反应。然后离心(1 200 r/min，5 min)，以D-Hank平衡盐溶液洗细胞2次，悬浮细胞，加到玻璃比色杯中，利用荧光分光光度计进行测定。先测定340 nm及380 nm激发光所产生荧光强度，然后加入Triton X-100(0.1%)，再测定340 nm和380 nm激发光所产生荧光强度，最后加入EGTA(5 mmol/L)，测定340 nm和380 nm激发光所产生荧光强度，按下列公式计算［Ca2+］i=Kd(Fd/Fs)×［(R－Rmin)/(Rmax－R)］。

1.8 钙调神经磷酸酶(CaN)蛋白活性测定 以2.5 ml/孔细胞悬液(1×106个/ml)接种到6孔培养板中，无血清培养液同步化经上述分组处理后，按照CaN活性剂盒按照操作说明进行测定。反应终止30 min后，在660 nm测定吸光度。标准曲线获得样品对应磷浓度，按下列公式计算CaN活性:CaN活性［nmol/(mg·min)］=［根据标准曲线获得样品对应磷浓度(μmol/L)×10(体系倍数)×样品稀释倍数］÷10(反应时间:min)÷样品蛋白质量浓度(mg/ml)。

2 结果

2.1 PDS对肥大心肌细胞表面积的影响 与正常对照组〔(4.95±0.37)μm2〕相比，肥大模型组心肌细胞伪足粗大，表面积［(7.06±0.64)μm2］增加，差异有统计学意义(P＜0.01)，表明AngⅡ引起了心肌细胞体积肥大;与肥大模型组相比，PDS低剂量组［(6.03±0.45)μm2］及高剂量组［(5.77 ±0.51)μm2］心肌细胞表面积减少(P＜0.05或P＜0.01)。

2.2 PDS对肥大心肌细胞总蛋白质含量的影响 与正常对照组相比，肥大模型组心肌细胞总蛋白质浓度及单个细胞蛋白质含量明显增加(P＜0.01)，表明AngⅡ引起了心肌细胞蛋白质合成增多;与肥大模型组相比，PDS低剂量组及高剂量组心肌细胞总蛋白质浓度及单个细胞蛋白质含量降低(P＜0.05)。见表1。

2.3 PDS对肥大心肌细胞内〔Ca2+〕i的影响 与正常对照组〔(142.6±13.8)nmol/L〕相比，肥大模型组心肌细胞内〔Ca2+〕i浓度〔(297.5±18.7)nmol/L〕明显增加(P＜0.01);与肥大模型组相比，PDS低剂量组〔(211.4±16.9)nmol/L〕及高剂量组〔(194.6±15.3)nmol/L〕心肌细胞内〔Ca2+〕i明显降低(P ＜0.05)。

表1 PDS对肥大心肌细胞总蛋白质含量的影响( s，n=10)

表1 PDS对肥大心肌细胞总蛋白质含量的影响( s，n=10)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 蛋白质浓度(mg/ml)细胞数(×105)单个细胞蛋白质含量(pg/细胞)11.97±0.62 3.01±0.11 863.4±62.2肥大模型组 16.31±0.531) 3.06±0.14 1018.0±77.41)PDS低剂量组 14.9±0.492) 3.03±0.10 943.6±70.52)PDS高剂量组 14.2±0.452) 3.02±0.11 928.9±68.32)正常对照组

2.4 PDS对肥大心肌细胞CaN蛋白活性的影响 与正常对照组〔(11.22 ±1.36)nmol·mg－1·min－1〕相比，肥大模型组心肌细胞内 CaN 活性〔(27.58 ±2.65)nmol·mg－1·min－1〕明显升高(P＜0.01);与肥大模型组相比，PDS低剂量组〔(18.24±2.16)nmol·mg－1·min－1〕及高剂量组〔(16.35 ±1.84)nmol·mg－1·min－1〕心肌细胞 CaN 活性明显降低(P ＜0.05)。

3 讨论

已有研究证明，神经体液因素(AngⅡ、ET-1)、肽类生长因子(FGF、TGF-β)及机械牵张刺激等〔7〕都具有促进心肌细胞肥大的作用。其中AngⅡ是目前被了解最多的血管收缩因子，通常被选择作为心肌细胞肥大的诱导剂，本实验以10－7mol/L浓度诱导原代培养的乳鼠心肌细胞48 h，成功建立细胞肥大模型。本实验结果显示，肥厚模型组表面积及总蛋白质含量均明显高于正常对照组，而PDS低剂量组及高剂量组能明显减少肥大心肌细胞的表面积及总蛋白质含量，表明PDS对AngⅡ诱导的细胞肥大有抑制作用。

另有研究发现，细胞内Ca2+参与细胞外各种刺激及细胞内功能紊乱所致心肌肥大〔8，9〕。当心肌肥大发生时，心肌细胞膜上钙离子受体密度增大，增加幅度与细胞肥大程度相关〔10〕。本实验结果显示，在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中，细胞内Ca2+含量明显升高，而PDS低剂量组及高剂量组可降低肥大心肌细胞内Ca2+含量，说明PDS能调整肥大心肌细胞内Ca2+含量，从而发挥其抑制心肌细胞肥大的药理作用。

CaN是一类丝/苏氨酸蛋白酶，依赖于钙及钙调素，主要表达于胞质。当钙和钙调素与CaN的调节亚单位和催化亚单位结合时，使CaN活化。CaN活化后与胞质活化T细胞因子3(NFAT3)结合，使其去磷酸化转位入核，与富含GGAAAAT的DNA结合区和锌指转录因子(GATA4)结合，诱导心脏胚胎期基因ANP、β-MHC等的表达，促进心肌肥大。本实验结果表明PDS对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的抑制作用与阻断钙调神经磷酸酶信号传导通路有关。

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5 韩 冬，曲绍春，于晓风，等.人参二醇组皂苷对心室重构大鼠的抗氧化作用及神经内分泌因子的影响〔J〕.中国实验诊断学，2010;14(11):1701-3.

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7 杨惠玲，潘景轩，吴伟康等主编.高级病理生理学〔M〕.北京:科学出版社，1998:224.

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9 Molkentin JD.Calcineurin and beyond:cardiac hypertrophic signaling〔J〕.Circ Res，2000;87(9):731-8.

10 Frey N，Olson EN.Calsarcin-3，a novel skeletal muscle-specific member of the calsarcin family，interacts with multiple Z-disc proteins〔J〕.J Biol Chem，2002;277(16):13998-4004.