iASPP蛋白抗体的制备及iASPP在结肠癌组织中的表达及意义

徐洪军 李晓莹 韩 笑 安丽萍 王海莉 关晓辉

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132001)

P53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族包括3个成员:ASPP1，ASPP2和iASPP〔1〕。ASPP1和 ASPP2蛋白与 P53结合后能激活P53的抑癌功能，iASPP与P53结合后可抑制P53的抑癌功能。本研究利用生物信息学软件分析人iASPP蛋白的二级结构、亲水性、疏水性和抗原性等理化性质，制备多克隆抗体，分析其与结肠癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 iASPP抗原与实验动物 iASPP抗原由本实验室制备，新西兰大白兔购自吉林省生物制品所。

1.1.2 资料选择 选取北华大学附属医院2005年1月至2010年12月住院手术治疗的结肠癌病人样本30例，其中男16例，女14例，年龄40～75(平均57.5)岁。正常结肠黏膜15例。标本来自北华大学附属医院病理科保存的蜡块。

1.1.3 试剂盒 S-P免疫组织化学染色试剂盒为美国Zymed公司产品，购自北京中山生物技术有限公司。Western印迹、ELISA试剂盒，购自北京西美杰生物技术有限公司。

1.1.4 主要试剂 完全和不完全弗氏佐剂购自北京鼎国生物公司;人iASPP蛋白和辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体购自Santa Cruz公司;化学发光法(ECL)试剂盒购自Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 登录进入http://www.ncbi.nlm.nih.gov，采用Blastn和Blastx程序，进行同源性检索和保守性分析。采用ProtScale程序、ExPASy工具包程序、SWISS PROT蛋白数据库和DNA star(Protean)生物信息学软件对iASPP的二级结构、抗原性、亲疏水性、结合位点、氨基酸的带电性等理化性质进行分析。

1.2.2 iASPP多肽的设计与合成 根据生物信息学分析和预测，按抗原性、亲疏水性和同源性分析，设计并合成一段多肽，即iASPP:NH2-TAFEKCDPYREGYADCATYL-COOH。多肽的合成与载体蛋白-血蓝素联接交由北京博奥森生物技术有限公司完成。多肽的合成采用9-氟甲氧羰基(Fmoc)固相合成法，利用高效液相法进行纯化，纯化后的样品再用高效液相色谱法(HPLC)分析，纯度为95%。

1.2.3 动物免疫 将纯化后的多肽抗原液250 μl与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后采用背部多点注射法免疫新西兰白兔。2 w后取多肽抗原液加等体积弗氏不完全佐剂相同方法加强免疫，以后每2周免疫1次，共5次，末次免疫后5～7 d于耳缘静脉取血，间接ELISA方法检测血清达理想效价后颈动脉放血，收集兔血清。

1.2.4 免疫兔血清采集及纯化 采用颈总动脉放血法收集兔血清。盐析法初步纯化兔血清。

1.2.5 间接ELISA方法测定血清效价 于注射免疫程序开始前和每次注射免疫后1 w，从兔耳缘静脉取血1 ml，离心取上清测定血清效价。经过包被、洗涤、封闭、洗涤、加一抗、洗涤、加二抗、洗涤、显色、终止反应等过程。酶标仪测定A492值，以(被检标本值－空白值)/(阴性对照值－空白值)即P/N≥2.1为阳性。

1.2.6 多克隆抗体的Western印迹鉴定 蛋白采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)转膜，以纯化的免疫兔血清为一抗，羊抗兔HRP-IgG抗体为二抗，以免疫前兔血清为阴性对照，通过ECL显色系统进行Western印迹检测。

1.2.7 免疫组织化学 取组织切片，应用过氧化物酶标记的链霉素染色进行免疫组织化学染色(S-P法):切片脱蜡，水化，水浴法抗原修复，3%H2O2阻断内源性氧化物酶活性。正常血清孵育，滴加 ASPP1抗体，4℃过夜，依次经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，孵育，二氨基联苯胺(DAB)染色后，苏木精复染，脱水，透明，封片。结果判断:用PBS代替一抗作阴性对照，用已知的阳性切片作阳性对照。染色结果判定以肿瘤细胞胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞，高倍镜下取4个视野计数200个细胞，按阳性细胞所占百分比将染色结果分为:阳性细胞＜5%为(－);5% ～25%为(+);25% ～50%为(⧺);＞50%为(⧻)。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行分析，采用计数资料四格表及四格表的确切概率法、相关分析等。

2 结果

2.1 多肽抗体的制备和效价 iASPP肽段具有良好的免疫原性，在接受第1次免疫后2 w，体内抗体滴度开始上升，5次主动免疫结束后即第9周，兔抗血清与多肽抗原发生强阳性反应，对照组兔血清不与多肽发生免疫反应。家兔免疫后获得的血清进行倍比稀释，随着血清稀释度的增加，其反应孔OD值降低，以 P/N≥2.1为阳性，间接 ELISA测定效价均大于1∶160 000，表明获得高效价的多抗。

2.2 多肽抗体的特异性 Western印迹分析结果显示转印至PVDF膜上的iASPP蛋白与免疫兔血清形成单一阳性染色带，与其蛋白分子量的理论值相符，兔阴性对照血清无条带出现，表明获得了抗iASPP的多克隆抗体。

2.3 iASPP与结肠癌的组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移的差异性及其在组织中的表达 癌组织不同分化程度者iASPP阳性率差异显著(P＜0.05);在不同浸润深度及有无淋巴结转移的患者间iASPP表达无显著性差异(P＞0.05)。结肠癌组织中iASPP的阳性表达率高于正常结肠组织(P＜0.05)。见表1，图 1。

表1 iASPP阳性表达与结肠癌的组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移的关系〔n(%)〕

图1 iASPP免疫组化结果(×10)

3 讨论

结肠癌以41～51岁发病率最高，从病因看大多数来自腺瘤癌变，在形态学上可见到炎症、增生、腺瘤、癌变各个阶段以及其对应的染色体改变。多种因素相互作用的结果导致了结肠癌的发生，其中结肠腺瘤是结肠癌发生的重要病因之一〔2〕。结肠癌的腺瘤-癌序列学说中，细胞增殖与凋亡失衡是结肠癌发生的重要机制。

P53是现今公认的与肿瘤发生发展相关性最高的抑癌基因之一〔3〕，近年新发现的ASPP蛋白家族，对P53起调控作用。其作用机制为:ASPP与P53结合形成ASPP-P53复合物作用于原凋亡基因启动子，ASPP的微小变化就可引起P53结合DNA的能力发生改变，从而影响P53诱导凋亡的能力。ASPP1，ASPP2与iASPP作用相反，iASPP是与ASPP1和ASPP2竞争P53的结合位点，影响ASPP-P53复合物与DNA结合的能力，从而阻止P53 的细胞凋亡功能〔4，5〕。

刘航等〔6〕对野生型P53和ASPP蛋白水平正常的8例乳腺癌患者的iASPP蛋白含量进行系统检测，测试结果有7例患者的iASPP含量都比较高。在急性白血病患者细胞中，Zhang等〔4，7，8〕的研究发现 iASPP mRNA 表达水平比正常者及急性白血病完全缓解者要高很多。在白血病细胞中，Liu等〔9，10〕研究发现ASPP1及ASPP2的mRNA低表达与iASPP的mRNA高表达共存的现象，阐述了ASPP1和ASPP2的表达升高和iASPP的表达下调，也许在白血病发病机制中起重要作用。

以上的研究证明，ASPP蛋白是体内P53的关键调节蛋白，ASPP1和ASPP2通过提高原凋亡基因的活力促进P53依赖的细胞死亡，而iASPP与其作用相反。该基因家族与肿瘤的关系具有普遍意义。有文献报道，在正常成人组织中，iASPP有低表达，而其他癌组织中，iASPP表达较为活跃，这与本研究结果部分相符。导致这一结果的原因可能与很多因素有关，还需继续研究与探讨。

综上，可以考虑通过提高ASPP1，ASPP2的高表达，抑制iASPP的表达来提高野生型P53诱导细胞凋亡的功能，达到促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的作用。

1 陈燕平，刘泽军.ASPP蛋白家族在肿瘤细胞凋亡中的作用〔J〕.癌变、畸变突变，2006;6:488-90.

2 陈 坤，舒国通，马新源，等.肠息肉与结直肠癌发病关系队列研究〔J〕.中国公共卫生，2004;20(2):168-70.

3 胡红艳，魏万里.ASPP基因家族与肿瘤的研究进展〔J〕.实用医学杂志，2009;25(15):2593-5.

4 方赞熙，黄如欣，张忠英.P53凋亡刺激蛋白抑制因子的研究进展〔J〕.医学综述，2007;13(9):661-2.

5 张 云，刘泽军.新的抑癌基因ASPP对P53作用的研究进展〔J〕.生命科学，2004;16(2):79-80.

6 刘 航，王 敏.P53调节蛋白ASPPs的分子生物学特性及其与肿瘤的关系〔J〕.医学分子生物学杂志，2007;4(5):427-30.

7 张 云，刘泽军，李 维，等.肿瘤细胞中ASPP2 mRNA的表达及意义〔J〕.第三军医大学学报，2003;25(23):2103-5.

8 Zhang X，Wang M，Zhou C，et al.The expression of iASPP in acute leukemias〔J〕.Leuk Res，2005;29(2):179-83.

9 Liu ZJ，Zhang Y，Zhang XB，et al.Abnormal mRNA expression of ASPP members in leukemia cell lines〔J〕.Leukemia，2004;18(4):880.

10 张 云，刘泽军，刘 彬，等.抑癌基因ASPP家族在肿瘤细胞株中的表达研究〔J〕.临床血液学杂志(输血与检验版)，2009;22(1):78-80.