蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub对2型糖尿病大鼠体重、血糖和胰岛素水平的影响

周庆峰 赵文峰 马 亢 滑 冰 (商丘师范学院生命科学学院，河南 商丘 476000)

磺酰脲类药物是目前应用最早、品种最多、临床应用也最为广泛的2型糖尿病口服治疗药物，其主要通过促进内源性胰岛素的分泌来降低血糖〔1〕。然而，磺酰脲类药物在应用过程中还是暴露出一些缺点。如药效持续性差、易导致患者出现低血糖症状、易产生耐药性等问题〔2〕。蛙皮抗菌肽(Brevinin-2Gub)是于2008年提取自亚洲青蛙皮肤的抗菌肽，由30个氨基酸所构成，除具有广谱的抗菌作用外，Brevinin-2GUb还具有显著的促胰岛素分泌作用，这种促分泌作用与国内外备受关注的胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)、肠促胰岛素的促分泌效果相近，因此有望成为一种新型的糖尿病治疗药物〔3，4〕。目前Brevinin-2Gub促胰岛素分泌的相关研究大都停留在体外细胞水平上，而对糖尿病大鼠动物模型的药效研究还很少〔5〕，因此，本研究选择实验性糖尿病大鼠动物模型，通过皮下注射方式，观察Brevinin-2Gub给药后对正常大鼠和糖尿病大鼠体重、血糖和胰岛素分泌情况的影响，同时选择临床常用促胰岛素分泌药物格列吡脲作为实验对照，旨在更全面了解该药物的生物药效特性。

1 材料与方法

1.1 动物 8周龄雄性SPF级Wistar大鼠56只，体重(200±20)g，由商丘师范学院生命科学学院实验动物中心提供。

1.2 实验试剂 Brevinin-2Gub购自上海吉尔多肽有限公司;胰岛素放射免疫试剂盒购自上海康源生物科技有限公司;快速血糖仪及血糖试纸购自罗氏诊断产品(上海)有限公司;链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司;格列苯脲片购自上海雷允上药业有限公司。

1.3 模型制备与分组 首先随机将大鼠分为2个大组，对照组(n=16)和模型组(n=48)。对照组采用常规饲料 (12%蛋白质、5%脂肪、67%碳水化合物、16%其他)喂养;同时又分为正常对照组(n=8)和正常给药组(n=8)，正常对照组仅注射等体积的生理盐水，正常给药组注射剂量为10 μg·kg－1·d－1的Brevinin-2Gub溶液。模型组采用高糖高脂饲料 (10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料)喂养。采用高脂饲料8 w(成肥胖鼠)后，采用40 mg/kg STZ进行腹腔注射，注射STZ 72 h后禁食10 h测定空腹血糖，不同时间内两次空腹血糖≥7.8 mmol/L，并稳定10 d以上，且造模前后大鼠体重无明显改变，即成2型糖尿病大鼠模型〔6〕。建模成功后，将模型组大鼠随机分为糖尿病组(n=8)，Brevinin-2Gub给药组(n=24)和格列苯脲组(n=8，每日给予灌胃50 mg·kg－1·d－1格列苯脲，连续 2 w)。Brevinin-2Gub 给药组再随机分为 Brevinin-2Gub 高剂量 (20 μg·kg－1·d－1)、中剂量(10 μg·kg－1·d－1)和低剂量 (5 μg·kg－1·d－1)组，每组 8只，每日皮下注射1次，连续2 w。正常对照组和糖尿病组给予等体积的生理盐水作为对照〔7〕。实验动物均采取单笼喂养。Brevinin-2Gub药物冻干粉按每天给药量分装于无菌离心管中，4℃保存，每次给药时用无菌 PBS溶解。

1.4 检测指标 体重检测:分别于治疗第3天、第7天和第14天，采用电子天平测量大鼠体重。空腹血糖检测:大鼠禁食10 h后，于其尾静脉采血，按照血糖仪的说明，采取大鼠尾静脉检测各组动物的空腹血糖。胰岛素检测:采用放射免疫试剂盒检测各组试验大鼠血清胰岛素水平变化。

2 结果

2.1 Brevinin-2Gub对实验大鼠体重的影响 正常对照组比较，糖尿病组体重明显降低(P＜0.01)，表明实验大鼠出现糖尿病高消耗症状。与糖尿病组比较，格列苯脲组和各剂量Brevinin-2Gub给药组在给药期间体重缓慢升高，说明Brevinin-2Gub能够在一定程度上缓解大鼠糖尿病高消耗症状，其中格列苯脲给药组大鼠体重水平增加最高，高剂量Brevinin-2Gub给药组次之，之后依次是Brevinin-2Gub中剂量组和低剂量组。见表1。

2.2 Brevinin-2Gub对实验大鼠血糖的影响 与正常对照组相比，正常给药组大鼠血糖水平变化无显著性差异，糖尿病组血糖显著升高(P＜0.01)，表明糖尿病大鼠模型造模成功。与糖尿病组比较，Brevinin-2Gub给药后，各剂量组糖尿病大鼠血糖在第3天、第7天和第14天均有明显下降，其中Brevinin-2Gub高剂量给药组第7天血糖降低较为显著(P＜0.01)。而与格列苯脲组相比，各剂量Brevinin-2Gub给药组处理后血糖降低水平均低于格列苯脲(P＜0.01)。见表1。

2.3 Brevinin-2Gub对实验大鼠胰岛素释放的影响 与正常对照组相比，正常给药组在第3天、第7天和第14天胰岛素水平均有上升(P＜0.01)。与糖尿病组比较，Brevinin-2Gub给药后，糖尿病大鼠胰岛素水平在第3天、第7天和第14天也均有明显上升(P＜0.01)，其中高剂量Brevinin-2Gub给药组胰岛素水平升高最为显著(P＜0.01)。而与格列苯脲组相比，各剂量Brevinin-2Gub给药组处理后胰岛素水平升高幅度均低于格列苯脲(P＜0.01)。见表1。

表1 蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub对实验大鼠体重、血糖、胰岛素释放的影响( s，n=8)

表1 蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub对实验大鼠体重、血糖、胰岛素释放的影响( s，n=8)

与对照组比较:1)P＜0.01;与糖尿病模型组比较:2)P＜0.01;与阳性药物对照组比较:3)P＜0.01

5 49.42±9.83正常给药组 209.5±27.5 246.8±21.7 266.2±24.8 6.63±0.42 6.06±0.28 6.39±0.46 58.52±10.741)59.92±9.751)61.25±9.381)糖尿病模型组 182.2±32.61) 214.9±31.61) 218.9±21.81) 23.21±1.621) 24.9±1.391) 21.42±1.851) 25.63±7.67 23.73±11.24 25.44±10.29低剂量组 186.6±22.13)4)219.1±21.33)4)219.2±28.33)4)22.33±2.012)4)21.10±1.763)4)19.62±1.353)4)26.34±9.192)3)25.56±7.713)4)25.62±9.313)4)中剂量组 196.8±31.92)3)212.3±26.72)3)211.1±34.72)3)20.85±1.523)4)19.36±0.773)4)19.12±1.733)4)29.83±8.463)4)29.34±7.873)4)29.14±7.663)4)高剂量组 198.4±23.22)3)225.6±21.42)3)227.9±26.82)3)19.46±1.283)4)18.2±1.443)4)18.9±1.273)4)30.63±7.373)4)30.91±8.433)4)31.95±8.273)4)格列苯脲组 197.9±30.6 225.3±32.1 236.7±21.1 17.91±0.86 15.34±1.17 14.72±1.21 35.92±0.86 36.63±1.正常对照组 212.7±29.2 248.1±26.8 267.4±31.3 6.62±0.31 6.17±0.43 6.43±0.37 49.23±12.31 49.56±11.8 15 39.77±1.46

3 讨论

蛙科是全球分布最广泛的两栖动物，种类超过650种，其皮肤分泌物是重要的药用资源之一，蛙皮抗菌肽就是这些活性化合物中最重要的一种〔8〕。近几年来，陆续发现了一系列具有促胰岛素释放作用的蛙皮抗菌肽，如 Brevinin-1、Brevinin-2、Pseudin-2和Esculentins-1等家族抗菌肽，这些抗菌肽可显著促进体外培养的胰岛细胞株的胰岛素分泌，有望替代磺酰脲类药物成为新型糖尿病治疗药物〔9，10〕，Brevinin-2Gub就是其中最有潜力的一种。因此在本研究中，我们选择了蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub作为研究对象，进一步明确蛙皮抗菌肽在糖尿病动物模型中的药理效应。

本文结果表明单独应用Brevinin-2Gub对正常大鼠体重无明显影响，而糖尿病组大鼠体重下降较为明显，一方面可能是由于造模过程中对大鼠身体产生的伤害，导致大鼠食欲下降，另一方面与糖尿病导致的高消耗也有密切关系。Brevinin-2Gub各剂量组均能显著减轻糖尿病大鼠高消耗症状，但改善糖尿病大鼠体重的长期效应要弱于磺酰胺类口服促胰岛素分泌药物。考虑到体重变化仅仅代表糖尿病治疗中的某一方面，因此，进一步观察Brevinin-2Gub对糖尿病大鼠血糖和血胰岛素水平的影响，对鉴定Brevinin-2Gub能否成为新一代糖尿病治疗药物，具有至关重要的意义。

本结果表明，Brevinin-2Gub可促进正常大鼠胰岛素水平显著上升，但对正常大鼠血糖水平却无显著影响，由此我们推测，Brevinin-2Gub降糖作用具有葡萄糖依赖性，只有在高血糖时候才具有显著的降糖作用，因此具有较小的导致低血糖风险。Brevinin-2Gub对造模糖尿病大鼠有降低血糖的作用，治疗期间不同剂量的Brevinin-2Gub组的血糖均明显低于仅糖尿病模型组，但降糖效应仍低于临床常用的磺酰脲类药物格列吡脲，这与目前国内外较为关注的糖尿病小肽治疗药物 exendin-4作用效果相近。

总之，本研究结果已证实了Brevinin-2Gub可有效降低糖尿病大鼠血糖水平，且具有较小产生低血糖风险，可显著减轻糖尿病大鼠消耗症状，并促进糖尿病大鼠体内胰岛素分泌，为其在糖尿病治疗中进一步的开发利用，打下一定的基础。

1 Korytkowski MT.Sulfonylurea treatment of type 2 diabetes mellitus:focus on glimepiride〔J〕.Pharmacotherapy，2004;24(5):606-20.

2 Holstein A，EgbeReal EH.Risk of hypoglycaemia with oral antidiabetic agents in patients with type 2 diabetes〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2003;111(7):405-14.

3 Conlon JM，Power GJ，Abdel-Wahab YH，et al.A potent，non-toxic insulin-releasing peptide isolated from an extract of the skin of the Asian frog，Hylarana guntheri(Anura:Ranidae)〔J〕.Regul Pept，2008;151(1-3):153-9.

4 Zhou QF，Li MY，Li CW.Cloning and expression of a novel insulin-releasing peptide，Brevinin-2GUb from Escherichia coli〔J〕.J Biosci Bioeng，2009;107(4):460-3.

5 Yang X，Lee WH，Zhang Y.Extremely abundant antimicrobial peptides existed in the skins of nine kinds of Chinese odorous frogs〔J〕.J Proteome Res，2012;11(1):306-19.

6 周庆峰，赵文锋，张向飞.蛙皮活性抗菌肽最新研究进展〔J〕.中国农学通报，2011;27(33):217-20.

7 Ramachandran S，Rajasekaran A，Kumar KT.Antidiabetic，antihyperlipidemic and antioxidant potential of methanol extract of Tectona grandis flowers in streptozotocin induced diabetic rats〔J〕.Asian Pac J Trop Med，2011;4(8):624-31.

8 Dourado FS，Leite JR，Silva LP，et al.Antimicrobial peptide from the skin secretion of the frog leptodactylus syphax〔J〕.Toxicon，2007;50(4):572-80.

9 Marenah L，Flatt PR，Orr DF，et al.Skin secretions of Rana saharica frogs reveal antimicrobial peptides esculentins-1 and-1B and brevinins-1E and-2EC with novel insulin releasing activity〔J〕.J Endocrino，2006;188(1):1-9.

10 Abdel-Wahab YH，Patterson S，Flatt PR，et al.Brevinin-2-related peptide and its(D4K)analogue stimulate insulin release in vitro and improve glucose tolerance in mice fed a high fat diet〔J〕.Horm Metab Res，2010;42(9):652-6.