微生物发酵制备莽草酸的含量测定

沈国鹏 ， 李 莉 ， 班春兰 ， 吴鸣建 ，2， 黄 强

（1.郑州大学 化工与能源学院，河南 郑州 450002；2.河南省化学学会，河南 郑州 450002）

人禽流行性感冒一直严重危害着人类的健康，仅在美国每年因流感住院的患者达15万人[1]。截止2013年4月21日，中国全国人感染H7N9禽流感确诊病例达104例，其中死亡21人[2]。莽草酸（结构见图1）是化学合成中重要的化工原料，具有抗炎镇痛和抑制血栓形成的作用，其本身及其衍生物在抗癌和抗病毒方面也有一定的作用[3-4]，可作为一些化学合成制剂和药物中间体，尤其是抗禽流感疫苗达菲的重要合成原料，在食品和化学工业中有着广泛的应用[5-8]。莽草酸存在于木兰科常绿灌木莽草的干燥果实八角中，除此之外，莽草酸还广泛存在于微生物中。因此可以通过微生物发酵提取莽草酸[9-10]，到目前为止，国外有两项通过大肠杆菌、枯草杆菌生产莽草酸的专利[11-12]。目前唯一可对流感治疗有效的药物达菲产量受限，全球供应吃紧，其主要原因之一是因为生产达菲的原料莽草酸的短缺。

八角茴香中莽草酸含量的测定通常采用高效液相色谱法[13]，用该法测定八角提取物中莽草酸含量时，需要使用大量的有机试剂，会给环境带来污染以及对操作人员造成伤害。到目前为止，国际上利用微生物发酵法合成莽草酸的研究尚处于实验室研究阶段，孙晓宇等[14]利用羟基苯甲醛比色法测定了莽草酸的含量。作者利用了紫外-可见分光光度法测定了发酵液中莽草酸的含量，为生物发酵生产莽草酸的研究提供了便捷可靠的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莽草酸标准品；实验用水为去离子水；莽草酸产生菌菌种 自选；发酵培养基：自制。

TG-16型高速离心机：巩义市予华仪器有限责任公司产品；WS70-1型红外快速干燥箱：巩义市英峪予华仪器厂产品；FA2004型电子分析天平：上海恒平科学仪器有限公司产品；WFZ UV-2102 PC型紫外可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 取50 mL莽草酸产生菌发酵液用离心机以12 000 r/min转速离心20 min，收集上清液，于245 nm测定吸光度。

1.2.2 对照品与供试品溶液的配制 对照品溶液准确称取红外烘干至恒重的莽草酸标准品0.503 8 g，溶于蒸馏水中，然后定容至100 mL，再从中取12 mL定容至50 mL容量瓶中。配制浓度为0.012 1 mg/mL。

供试品溶液 取发酵液，经多次分析其莽草酸含量，取其平均质量浓度为0.097 2 mg/mL。

1.2.3 校准曲线的绘制 准确称取对照品溶液1、2、4、5、6、7、8、9、10 mL 分别置于 50 mL 容量瓶中，加蒸馏水稀释至定容刻度，摇匀。质量浓度为0.024 2、0.048 4、0.096 7、0.120 9、0.145 1、0.169 3、0.193 5、0.241 8 mg/mL。用分光光度计在245 nm测样品的吸光度，绘制莽草酸标准曲线，列出线性回归方程。

2 结果与分析

2.1 校准曲线方程

根据测定结果选x轴为莽草酸浓度，y轴为吸光度作图计算，回归线性方程为y=3.084 4x-0.004 8。 相关系数：R2=0.999 9（n=8）。 检出限（按 S/N=3计）为 0.002 5 mg/mL，其线性范围为 0～0.3 mg/mL。表明在245 nm波长下，吸光度与莽草酸浓度有着显著的线性关系，可据此方程测定莽草酸（见图1）。

图1 莽草酸的线性回归图Fig.1 Linear regression graph of shikimic acid

2.2 方法考察

2.2.1 精密度及准确度实验 准确移取供试品溶液进行精密度测定，测得值为0.097 2、0.097 5、0.097 9、0.097 2、0.097 2、0.096 9、0.097 2 mg/mL。相对标准偏差RSD为 0.32%（n=7），表明具有较高精密度，相对误差为0.10%，表明具有较高的准确度。

2.2.2 稳定性实验 取发酵处理液，室温下放置0、4、8、12、24、48 h 后进行测定， 测得值为 0.104 0、0.103 7、0.103 4、0.102 7、0.102 1、0.101 1 mg/mL。相对标准偏差RSD为1.06%，表明供试溶液室温放置48 h内稳定。

2.2.3 加标回收率实验 加标回收率是分析人员在样品测定时主要的质量控制方法。其大小不仅反映分析人员的操作技术水平，也反映出分析方法是否适用，以便及时的发现分析问题，确保数据的准确性和可靠性[15]。

由此准确称取对照品 0.055 9、0.054 0、0.056 0、0.051 1、0.052 8、0.051 9、0.056 7 g 于烧杯中，用去离子水溶解并转入50 mL容量瓶中，分别加入经分析测定质量浓度为0.128 2 mg/mL的样品，用去离子水定容在245 nm波长处进行分析，测定结果见表1。

表1 加标回收率Table 1 Adding standard recovery

测得回收率在96.7%～103.7%之间，平均回收率为100.04%。说明该方法准确性较好，基本可以保证测量结果的可靠性。

2.3 发酵液中莽草酸的质量浓度的检测

按照上述检测方法测定一系列发酵液中莽草酸的质量浓度（4种产生菌发酵液），结果见表2。

紫外-可见分光光度方法的最低检出限为0.002 5 mg/mL，表2数据与标准样配置样分析结果基本一致，表明可以满足检测要求。

表2 不同菌体发酵液中莽草酸的质量浓度Table 2 Shikimic acid concent of different bacteria fermented liquid

3 结语

利用紫外-可见分光光度计对微生物发酵生产莽草酸含量的测定，莽草酸的线性方程为A=3.084 4C-0.004 8，相关系数R2=0.999 9。方法的精密度为0.32%，准确度为0.10%，测得加标回收率在96.7%～103.7%之间，平均回收率为100.04%，供试溶液室温放置48 h内稳定性良好，方法简便快捷，适于微生物发酵生产莽草酸含量的快速测定。

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