硅酮凝胶对增生性瘢痕模型中胶原表达的影响

陈 翔 农晓琳 陈 灵

广西医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，南宁 530021

硅酮凝胶对增生性瘢痕模型中胶原表达的影响

陈 翔 农晓琳△陈 灵

广西医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，南宁 530021

目的研究硅酮凝胶对兔耳瘢痕模型中胶原的影响，探讨硅酮凝胶的作用机制。方法构建兔耳增生性瘢痕模型，在术后28 d外用硅酮凝胶喷雾剂，术后56 d处死动物切取兔耳瘢痕，采用免疫组化的方法观察瘢痕中Ⅰ、Ⅲ型胶原的变化情况。结果硅酮凝胶组较空白对照组瘢痕增生明显减轻，硅酮凝胶可以抑制瘢痕中Ⅰ型胶原的形成，并对Ⅲ型胶原分泌有一定的促进作用。结论硅酮凝胶可以显著抑制Ⅰ型胶原的形成，调节Ⅰ、Ⅲ型胶原的比例，从而改变细胞外基质的构成，减轻瘢痕增生。

瘢痕； 硅酮凝胶； 胶原； 免疫组化

增生性瘢痕是病理性瘢痕中的一种主要类型，常导致瘙痒、疼痛、活动障碍等诸多并发症，其主要病理学特征是大量成纤维细胞增生和胶原的过度沉积[1]。对于病理性瘢痕的防治一直是研究的热点，目前主要以手术和非手术治疗为主，但仍然缺乏足够的认识和特效的治疗手段及药物[2]。医用硅酮凝胶喷雾剂(疤复新)是目前市场上销售的防治瘢痕的外用药物，对增生性瘢痕的治疗具有一定的效果。本研究目的在于观察硅酮凝胶对增生性瘢痕地作用，并从对胶原表达的影响方面了解其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验对象与试剂

选取8只清洁级的健康新西兰大耳白兔，体重2.0～2.5 kg，兔龄3～4个月，雌雄不限(不含孕兔)，兔耳发育良好无畸形(由广西医科大学动物实验中心提供)。单只分笼适应性饲养48 h(人工混合饲料)，兔室温度在18 ℃～22 ℃之间，相对湿度介于60％～80％。医用硅酮凝胶喷雾剂(上海上大吉申科技开发有限公司)，CollagenⅠ鼠抗兔单克隆一抗(英国ABCAM公司)，Collagen Ⅲ 鼠抗兔单克隆一抗(美国NOVUS公司)，通用型山羊抗鼠二抗、免疫组化试剂盒及DAB试剂盒(均为北京中杉金桥公司)，复合消化酶(武汉博士德公司)。

1.2 动物处理及标本制备

于兔耳腹侧参照相关文献[3-5]方法建立增生性瘢痕模型，每只兔耳6个创面，每组共96个创面，术后置于原环境继续饲养。术后第28天可见兔耳创面基本愈合，形成早期的增生性瘢痕。按随机数字表法将动物随机分为两组：空白对照组(不加任何干预)和硅酮凝胶组(使用疤复新，喷涂于兔耳瘢痕，早晚各一次；药物使用方法参照说明书，并使药物均匀覆盖于瘢痕表面)。用药期间动物未见异常，无舔食药物、咬耳等现象。持续用药至术后第56天(即用药后28 d)，处死动物，切取兔耳瘢痕标本及正常兔耳皮肤，将标本置于4％多聚甲醛中固定。

1.3 实验方法

1.3.1 苏木精-伊红染色 流水冲洗固定标本，常规脱水、透明，石蜡包埋，制备厚度约5 μm的石蜡切片。烤片后，脱蜡复水，常规苏木精-伊红染色，脱水干燥后，封片，置于显微镜下观察。

1.3.2 免疫组化(SP法) 将已包埋好的标本，以5 μm的厚度连续切片。常规脱蜡、水化，PBS冲洗。复合消化酶进行抗原修复后，PBS冲洗，过氧化氢阻断，PBS冲洗，山羊血清孵育，倾去后滴加一抗(collagenⅠ、Ⅲ抗体浓度均为1∶500)，4 ℃过夜(阴性对照组以PBS替代一抗)。次日PBS冲洗，滴加二抗，PBS冲洗。DAB染色，显微镜下观察，彻底冲洗后，苏木精复染返蓝。脱水、透明，中性树胶常规封片，镜下观察，并用IPP软件分析。

1.4 图像分析

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 大体观察

术后28 d，两组增生性瘢痕形成明显，较周围正常皮肤突起，色红，质地较硬；用药28 d后，空白对照与术后28 d相比未见明显变化；硅酮凝胶组瘢痕变平，色泽及质地与周围正常皮肤相近。

2.2 镜下观察

苏木精-伊红染色可见，空白对照组瘢痕厚度增加，胶原及成纤维细胞增多，胶原纤维粗大致密且排列紊乱无章，并有胶原结节和旋涡状结构形成；硅酮凝胶组瘢痕厚度增生不明显，胶原纤维较细且排列较为规则，成纤维细胞数量较少，结构更接近正常皮肤。两组用药前后差异明显。

免疫组化显示，空白对照组瘢痕胶原染色后显棕黄色，呈强阳性表达，Ⅰ、Ⅲ型胶原均有所增加，其中Ⅲ型胶原增加较为明显，Ⅰ/Ⅲ型胶原发生变化。硅酮凝胶组瘢痕胶原染色后显黄色，呈阳性表达，Ⅰ型胶原明显减少，Ⅲ型胶原有所增加，Ⅰ/Ⅲ型胶原比值发生显著变化；较空白对照组更为接近正常皮肤的表达情况。以PBS替代一抗的阴性组胶原未见阳性表达。硅酮凝胶组用药后Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达与空白组比较差异具有统计学意义(Plt;0.05)。见图1、表1。

图1 各组Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达(苏木精-伊红染色)

表1 各组Ⅰ、Ⅲ型胶原的平均光密度值

与空白对照组比较*Plt;0.05

3 讨论

3.1 病理性瘢痕

皮肤病理性瘢痕是临床多发病和常见病，其形成及发展与遗传、治疗等诸多方面有着密切的联系，但主要的特征为成纤维细胞的过度增生和胶原蛋白代偿失调导致的异常堆积。作为细胞外间质的主要成分的胶原，调控其增生、分解，将会在病理性瘢痕发生发展过程中起到举足轻重的作用。

3.2 瘢痕模型

由于瘢痕的防治一直困扰着人类，为获得一种有效而稳定的动物瘢痕模型是学者努力研究的方向。动物模型的设计应遵循可靠、相似、易行、经济、可重复性等原则。目前动物瘢痕模型主要有裸鼠、新西兰大耳白兔、豚鼠等动物，并得到学术界的认可。其中裸鼠和兔耳作为瘢痕模型较为理想；但由于裸鼠不能自身产生增生性瘢痕，而兔耳瘢痕模型制取方便易行，且在增生性瘢痕形成过程中胶原的含量及比例与人增生性瘢痕极为相似，是研究瘢痕中胶原表达变化较为理想的动物模型[6-8]。

3.3 胶原蛋白

胶原蛋白在皮肤、肌腱、软骨等结缔组织中广泛存在，对机体起着支持、连接等诸多作用，是细胞外基质的主要成分。Ⅰ型胶原较为粗大在皮肤中主要起支持作用，而Ⅲ型胶原包绕着Ⅰ型胶原起到连接和物质交换等作用。Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白作为病理性瘢痕细胞外基质中含量最多的两类胶原蛋白，其过度沉积和降解减少是增生性瘢痕形成的主要原因[9]。病理性瘢痕中胶原蛋白较正常皮肤中的含量明显不同，胶原纤维的排列也十分紊乱，并可出现漩涡状结构和胶原结节。通常表现为在真皮中的胶原蛋白总量明显增加，但瘢痕组织以Ⅰ型胶原蛋白增加为主，而增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白均明显增加，以致两者的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白比例有明显差异。由此可见对胶原总量和Ⅰ、Ⅲ型胶原比例的调控对防治瘢痕有着决定性的作用。

3.4 硅酮凝胶

硅酮凝胶喷雾剂是目前市场出售防治瘢痕的药物之一，为硅酮制剂的喷雾型。临床上主要用于多种创伤及外科手术后的瘢痕的预防和辅助治疗，对潜在疤痕的增殖及创面部位的痛痒症有良好的止痛止痒效果；其对增生性瘢痕效果较好，但作用机制仍未完全清楚[10]。本实验通过构建兔耳增生性瘢痕模型，外用硅酮凝胶喷雾剂，证实硅酮凝胶制剂对成纤维细胞的增殖有抑制作用，使细胞数量减少，胞体减小，导致成纤维细胞内质网分泌的前胶原量发生改变，减轻了Ⅰ型胶原的沉积，并能改变增生性瘢痕中Ⅰ、Ⅲ型胶原的比例，从而达到防治瘢痕的目的，为进一步利用硅酮制剂防治瘢痕提供了相关的依据。

[1]LEE WJ，KIM YO，CHOI IK，et al.Adenovirus-relaxin gene therapy for keloids：implication for reversing pathological fibrosis[J].Bri J Dermatol，2011，165(3)：673-677.

[2]GAUGLITZ GG，KORTING HC，PAVICIC T，et al.Hypertrophic scarring and keloids：pathomechanisms and current and emerging treatment strategies[J].Hypertrophic Scars and Keloids，2011，17(1-2)：113-125.

[3]MORRIS DE，WU L，ZHAO LL，et al.Acute and chronic animal models for excessive dermal scaring：quantitative studies[J].Plast Reconstr Surg，1997，100(3)：674-681.

[4]李荟元，刘建波，夏炜，等.增生性瘢痕动物实验模型的建立与应用[J].中华整形外科杂志，2001，17(5)：276-278.

[5]陈灵，农晓琳，陈翔，等.硅酮凝胶喷雾剂局部喷涂对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究[J].中国临床新医学，2012，5(5)：393-396.

[6]GISQUET H，LIU H，BLONDEL WC，et al.Intradermal tacroliums prevent scar hypertrophy in a rabbit ear model：a clinical，histological and spectroscopical analysis [J].Skin Res Technol，2011，111(7)：1600-l604.

[7]RAHMANI-NEISHABOORI E，YAU FM，JALILI R，et al.Improvement of hypertrophic scarring by using topical anti-fibrogenic/anti-inflammator factors in a rabbit ear model[J].Wound Repiar Regen，2010，18(7)：401-406.

[8]AKSOV B，ATAKAN N，AKSOV HM，et al.Effectiveness of topical zinc oxide application on hypertrophic scar development in rabbits[J].Burns，2010，36(9)：1027-1035.

[9]BOSMAN FT，STAMENKOVIS I.Functional structure and composition of the extracellular matrix[J].J Pathol，2003，200(4)：423-428.

[10]KIM GG，KU SK，LEE DW，et al.Effects of silicone-based gels containing allantoin，dexpanthenol and heparin on hypertrophic scarring in the rabbit ear model[J].Drug Dev Res，2012，73 (3)：146-153.

InfluenceofSiliconeGelonCollagenExpressioninHypertrophicScarModel

CHEN Xiang，NONG Xiaolin，CHEN Ling

DepartmentofOralamp;MaxillofacialSurgery，CollegeofStomatology，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China

ObjectiveTo study the influence of silicone gel on the collagen expression in the scar of rabbit ear hypertrophic scar model，in order to probe the mechanism of silicone gel.MethodsSilicone gel spray was used 28 days after operation to construct rabbit ear hypertrophic scar model.The rabbits were sacrificed 56 days after operation to collect scar of rabbit ears.Collagen type Ⅰand Ⅲ alteration in the scar was observed using immunohistochemical method.ResultsScar hyperplasia in the silicone gel group reduced significantly，compared to that in the control group.Silicone gel inhibited typeⅠcollagen formation significantly and have a certain role in promoting type Ⅲ collagen secretion in the scar.ConclusionSilicone gel can significantly inhibit the collagen typeⅠformation，adjust the proportion of type Ⅲ collagen，resulting in changes in extracellular matrix composition and reducing the scar hyperplasia.

scar；silicone gel；collagen；immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.01.006

△通信作者，Corresponding author，E-mail：lab.nong@gmail.com

2012-11-28)