参麦注射液对大鼠肢体缺血-再灌注损伤后骨骼肌细胞凋亡的影响

林 楠 谢庆平 郭恩琪 浙江省人民医院 杭州310014

缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury），是显微外科肢体创伤修复，断肢再植等不可避免的问题，骨骼肌在重新获得血液灌注或氧供后，不仅不能使其恢复，反而因此导致组织代谢障碍及结构破坏进一步加重[1]，直接影响着创面修复、功能恢复的成功与否。参麦注射液（shenmai injection）由红参、麦冬加工、提炼、精制而成，源出《症因脉治》之参麦饮，具有益气养阴，生津复脉之功效。本实验探讨参麦注射液对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护机制，为临床应用获取实验基础。

1 实验材料

1.1 动物与分组 选用SPF级SD 大鼠30 只，雌雄不限，体质量200～220g，自由饮水，室温（25±2）℃，分笼喂养。由浙江省医学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK（浙）2008-0033）。30 只大鼠按随机数字表法，分为缺血再灌注模型组，缺血再灌注参麦组和假手术组，每组10 只。

1.2 主要试剂 参麦注射液（杭州正大青春宝药业有限公司提供，每支10mL，批号010873），免疫组化染色试剂盒（美国ZYMED 公司生产，杭州达文生物有限公司提供）Bcl-2 单抗、Fas 单抗（北京博奥森生物技术有限公司生产，杭州达文生物有限公司提供）。

2 实验方法

2.1 模型建立 所有动物在实验前夜停止喂食，不禁水。用10%水合氯醛，0.4mL/0.1kg 腹腔注射麻醉，每3h 追加1 次（0.2mL/0.1kg）以维持麻醉。大鼠仰卧位，四肢固定于木板上，腹股沟区脱毛，常规消毒。取右下肢腹侧切口,显露股动脉、静脉，用无创手术缝线活结扎闭股动静脉，并于手术显微镜下观察，确认血流阻断后，将股骨干后方肌群完全切断，再将肌肉原位缝合，关闭皮肤。缺血4h 后，打开右侧皮肤切口，解除结扎线，手术显微镜下观察血流恢复，管腔内无血栓，则再灌注成功。缝合皮肤，可以观察到动脉血流恢复后手术鼠爪由暗紫为粉红。假手术组不结扎股动静脉，4h 后给予生理盐水4mL/kg 腹腔注射。模型组在恢复血流，即再灌注即刻，给予生理盐水4mL/kg 腹腔注射；参麦组再灌注即刻，给予参麦注射液4mL/kg 腹腔注射[按成人体表面积换算：大鼠（200g）/人（70kg）=0.018/1]。

2.2 取 材 模型组与参麦组分别予再灌注1h，假手术组为5h 后的时间点，经腹主动脉放血致死动物后即刻切取患肢腓肠肌组织，所取组织用4%多聚甲醛及时固定，待做石蜡切片及免疫组化检测。

2.3 观察指标 免疫组织化学染色：按免疫组织化学染色剂盒程序进行。石蜡片常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS（pH7.4）缓冲液浸泡5min，3%H2O2去离子水孵育10min，滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15min，倾去，滴加一抗（兔抗Bcl-2，兔抗Fas 均为1:100），4℃冰箱过夜。PBS（pH7.4）缓冲液冲洗3 次，每次3min，加二抗（山羊抗兔IgG)37℃孵育15min，PBS（pH7.4）缓冲液洗3 次，每次3min，滴加辣根酶标记链酶卵蛋白素工作液（S-A/HRP），37℃孵育15min，PBS（pH7.4）缓冲液洗3 次，每次3min，DAB 显色剂显色15min，自来水终止显色。

2.4 结果分析 应用BI-2000 医学图像分析系统软件对腓肠肌组织切片进行分析，低倍镜下（×100）以相同外部条件（亮度）摄取图像，每张切片随机选择3个视野，得出统计场平均光密度值（AOD），每个实验组分别选取相应的切片，计算骨骼肌细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）。高倍镜下,随机计数1000个骨骼肌细胞核，平均100个细胞核中呈现阳性反应的数目为AI。

3 实验结果

3.1 显微镜观察 Bcl-2 阳性细胞染成棕黄色颗粒状为基因表达阳性，Fas 阳性细胞染成棕黄色或棕褐色颗粒状。光学显微镜下观察大鼠腓肠肌的肌细胞，模型组Fas 阳性细胞数量较多，胞浆淡棕色深染，且胞浆内棕黄色或棕褐色颗粒较多，排列密集，Bcl-2的表达较少，胞浆淡染，胞浆散在棕黄色或黄色颗粒。参麦组少量Fas 阳性细胞表达，棕黄色或黄色颗粒，散布于胞浆，胞浆颜色淡染，Bcl-2 阳性细胞数量多，胞浆颜色深染，且胞浆内棕黄色或棕褐色颗粒较多，排列密集。

3.2 Bcl-2 及Fas 蛋白表达 与假手术组比较，模型组Fas、Bcl-2 表达均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，参麦组Fas 表达显著降低，Bcl-2 表达提高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组大鼠腓肠肌组织Bcl-2 及Fas 蛋白表达比较（）

表1 三组大鼠腓肠肌组织Bcl-2 及Fas 蛋白表达比较（）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05

4 讨论

肢体缺血再灌注损伤是临床显微外科创伤，如断肢再植、四肢大血管损伤、血栓形成[2]、血管危象的再通、骨筋膜室综合征等常见的病理过程。骨骼肌缺血再灌注，轻者可致肌肉纤维化挛缩，影响功能；重者可致肢体坏死、截肢，甚至危及生命。临床上四肢手术使用止血带止血时肢体也有血循环中断和复流过程，与缺血再灌注生理病理过程相似。因此设法减轻肌肉缺血坏死程度有很大的临床意义。

细胞凋亡是骨骼肌缺血再灌注损伤的重要病理改变[3]。Fas 蛋白具有很强的凋亡诱导作用，它广泛存在于各种组织和器官，具有介导细胞凋亡，调节炎症反应及免疫反应，维持自身稳定作用。有研究表明[4]，细胞凋亡传导信号显著由肿瘤坏死因子（TNF）家族Fas，TNF 相关的凋亡诱导配体（TNF-related apopto sis-inducing ligand，TRAIL）激活。Fas 和TRAIL 这一凋亡诱导因子，将死亡信号传递至胞内激活半胱氨酸蛋白酶系统，最终导致细胞凋亡[5]。而且Fas 系统诱导细胞凋亡与Bcl-2的低表达相偶联。

Bcl-2 属抗凋亡亚族，它的蛋白分子C 端的羧基具有疏水性，含有一个由19个氨基酸伸展形成的跨膜结构，常位于线粒体膜，对维持线粒体结构和功能的完整性起重要作用，它可调节线粒体通透性粒转换孔道，阻止C-myc（一种原癌基因）介导的凋亡，抑制与还原型谷胱甘肽含量下降相关的凋亡。实验发现缺血预处理可诱导Bcl-2 基因表达增加，可诱导抗凋亡，产生保护机制[6]。

参麦注射液主要含有人参皂苷、人参多糖、甾苷、有机酸等成分，这些有效成分能加强机体器官抗应激能力，调节和促进机体免疫能。中医认为，其通过扶助正气，达到正气盛而邪有所制，所谓“扶正祛邪”。人参皂苷具有抗应激、抗氧化、抗缺血等作用，参麦注射液通过减少c-fos 基因的表达、调节血小板源生长因子（PDGF）、显著增加Bcl-2 基因表达、减少细胞凋亡数目，保护脑损伤[7]。

本实验观察到，骨骼肌组织缺血再灌注时，肌纤维细胞受到破坏。与假手术组相比，模型组Fas 表达显著增高（P＜0.01），而抗凋亡基因Bcl-2 表达亦增高（P＜0.01）；参麦注射液治疗后明显优于模型组、假手术组，Bcl-2 表达明显高于模型组（P＜0.05），Fas 表达明显低于模型组（P＜0.05），表明参麦注射液能够促进抑制凋亡基因Bcl-2 表达，抑制促进凋亡基因Fas表达，调节各凋亡基因之间的平衡，提高骨骼肌对长时程缺血的耐受性，减轻骨骼肌缺血再灌注损伤的程度，保护骨骼肌细胞并改善其功能紊乱的作用。

参麦注射液对防治骨骼肌缺血再灌注损伤的疗效值得肯定，但骨骼肌缺血再灌注组织损伤的机制是一个多因素参与的复杂过程，参麦注射液如何在各发病环节发挥干预和调节作用，还有待于进一步研究。

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［5］Koide N，Morikawa A，Tumurkhuu G，et al.Lipopolysaccharide and interferon-γ enhance Fas-mediated cell death in mouse vascular endothelial cells via augmentation of Fas expression［J］.Clin Exp Immunol，2007，50（3）：553-560.

［6］Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family proteases and apoptosis［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2005，37（11）：719-727.

［7］Cheng JY，Huang JC，Liu GY，et al.Effect of shenmai injection on the expression of hippocampal c-fos gene of rats with ischemic cerebral injury［J］.Chinese Journal of Clinical Rehabilitation，2005，9（32）：228-229.