原发性胆汁性肝硬化患者自身抗体检测的临床分析

齐国海 张凤兰 宁新丽 赵彦丛

原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一种发病机制未明却与自身免疫系统有关的慢性肝病，组织病理学检测可发现肝内小胆管有非化脓性炎性病变。有研究显示，90%以上的PBC患者其血清中能够检测到抗线粒体抗体(antimitochondrial antibodies，AMA)，因此，可以将 AMA 作为诊断PBC的有效血清学标志［1］。采用间接免疫荧光法(indirect immunofluoresence，IF)检测PBC患者血清时，其中会出现两种不同抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)的荧光染色，即多核点型(multiple nuclear dots，MND)ANA和核膜型 (nuclear envelope，NE)ANA，这两种抗体可被看作PBC的血清学特异性抗体［2］。而MND-ANA主要能识别两种细胞核蛋白，即Sp100和早幼粒细胞白血病抗原(promyelocytic leukemia antigen，PML)［3］。本研究应用 IF及免疫印迹法(immunology blot，IB)对60例PBC患者血清中的MND-ANA和抗-Sp100抗体进行检测，探讨MND-ANA以及抗-Sp100抗体用于疾病的诊断和在临床中的意义。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选取涉县医院2009年1月1日至2011年10月30日的住院及门诊PBC患者60例(研究组)，其中男14例，女46例;年龄30～76岁，平均年龄(56±10)岁。对照组选择涉县医院同期住院及门诊患者43例，其中慢性乙型肝炎10例，慢性丙型肝炎7例，干燥综合征12例，自身免疫性肝炎7例，健康者7例。每例患者临床资料均详细可查。采集2组血清，－20℃保存待测。诊断标准参照［4－6］。肝脏病理学检查:选择PBC患者中的50例行肝脏病理检查，所取肝组织常规石蜡包埋，HE与Masson染色，阅片由同一位高年资病理医师进行。

1．2 方法 以IB法检测肝特异性自身抗体AMA-M2、平滑肌抗体(SMA)、核点蛋白SP100抗体、肝肾微粒体1型(LKM-1)抗体、GP210抗体和肝细胞溶质抗原I型(LC-1)抗体。以IF检测肝ANA、可提取性核抗原(ENA)多肽抗体谱和双链DNA(ds-DNA)。以免疫散射比浊法检测免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和补体 C3、C4。

1．3 组织学分期标准［7］Ⅰ期为汇管区炎症仅限于汇管三角;Ⅱ期为显著的汇管及汇管周围炎症，且无间隔纤维化或桥接样坏死;Ⅲ期为小叶纤维化和(或)桥接样坏死;Ⅳ期为肝硬化。

1．4统计学分析应用SPSS 10．0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料比较采用 χ2检验，P ＜0．05为差异有统计意义。

2 结果

2．1 IF法检测患者的ANA结果 检测患者的ANA结果通过RBE细胞观察其中的60例ANA免疫荧光模式，结果显示25．0%(15/60)呈现 MND 荧光染色阳性，15．0%(9/60)呈现核膜型，8．3%(5/60)呈现着丝点型，均质型2例，斑型6例。15例MND-ANA阳性患者中AMA阴性PBC患者5例，AMA阳性PBC患者10例。对照组12例干燥综合征患者中有MND-ANA阳性1例，着丝点型1例，斑型5例。7例自身免疫性肝炎患者中均质型ANA 4例，斑型ANA 1例，MND-ANA阳性2例。而慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和健康者对照均为阴性。见表1。

表1 IF检测患者的ANA结果 例

2．2 PBC患者抗-SP100阳性和阴性的临床结果 抗-SP100阳性和阴性PBC患者的相关结果差异无统计学意义(P＞0．05)，但IgG差异有统计学意义(P ＜0．05)。见表2。

表2PBC患者抗-Sp100阳性和阴性的相关结果±s

表2PBC患者抗-Sp100阳性和阴性的相关结果±s

项目 抗-Sp100阳性(n=17) 抗-Sp100阴性(n=43) P值55±7 57±11 ＞0．05 ALT(U/L) 90±17 90±21 ＞0．05 AST(U/L) 1 667±1 184 1 634±1 084 ＞0．05 ALP(U/L) 412±51 418±54 ＞0．05 GGT(U/L) 318±68 324±68 ＞0．05 TBIL(μmol/L) 35±22 36±30 ＞0．05 IgG(g/L) 24±6 15±5 ＜0．05 IgA(g/L) 5．2 ±1．5 4．6 ±2．4 ＞0．05 IgM(g/L) 6．0 ±3．9 5．8 ±2．8 ＞0．05 AMA［例(%)］ 17(100) 43(100) ＞0．05病理早期(Ⅰ/Ⅱ，例) 6 17病理晚期(Ⅲ/Ⅳ，例)年龄(岁，images/BZ_562_2176_2014_2208_2059.png±s)7 20 ＞0．05

3 讨论

有文献证实 MND-ANA能够识别位于核体上的蛋白［2］。核体是与核基质相关的多蛋白复合体，它主要包括NDP55、PML、Sp 100和rfp及SUMO-1等。Sp 100蛋白是一种磷酸化的细胞核蛋白，在电泳移动中其相对分子量为100 ku。Szostecki等［8］首先观察到PBC患者血清中的MND-ANA能识别分子量约100 ku的蛋白，并且将其命名为Sp 100。目前，已知的是Sp 100为转录活化因子中的一种，适当条件下能观察到Sp 100蛋白和mRNA的升高状态。此外目前对Sp100的其他功能所知较少。

跟其他自身免疫性疾病相似，在PBC患者的血清中除去AMA外还有ANA存在，使用IF法检测此类血清时，ANA的染色模式分别有斑型、MND、核膜型、着丝点型和均质型以及核仁型等，本研究结果揭示MND及核膜型的ANA可被认为是PBC患者的特异性自身抗体。有研究描述了MND-ANA免疫荧光的模式，并且发现它的特点是有3～20个大小(0．3～1 μm)不一的点状染色出现，分布位置是除核仁外的整个细胞核中［9］。

本研究中使用IF法检测60例PBC患者的血清，发现有15例MND-ANA阳性，阳性率为25．0%;对照组仅在干燥综合征和自身免疫性肝炎患者分别出现1例阳性，由此可推断MND-ANA是PBC的特异性自身抗体，与相关研究［8］结论相符。Luettig等［10］对施行肝移植手术后的PBC患者的跟踪随访资料发现，移植术后尽管ANA的滴度下降趋势明显，但血清中的ANA仍呈持续存在状态，且其免疫荧光反应模式也几乎未改变。这就更加显著地揭示了MND-ANA确为PBC的特异性自身抗体，甚至是病变靶器官已经被去除的状态下该抗体依然能被检测到。本研究在IF的基础上，又采用免疫印迹法检测分析MND-ANA阳性的PBC患者体内的抗-Sp100抗体。在所选择的全部60例PBC患者中，检测到抗-Sp100阳性17例，阳性率为28．3%，而对照组中只有1例患者检测到抗-Sp100，这也提示了抗-Sp100是PBC特异性的血清自身抗体。

AMA是诊断PBC的血清学标志物之一，有研究采用IF法检测AMA的阳性率约为80%，但换用敏感性更好的检测方法如免疫印迹法或者酶联免疫吸附法后，仍会有5%～10%的PBC患者出现AMA阴性［11］。结合本研究结果和文献［9］，笔者建议如果有临床与组织学的检查结果均符合PBC的诊断标准而AMA阴性情况的患者，进一步选择MND-ANA检测可能会有助于诊断PBC，这样也可以避免遗漏和延误AMA阴性的PBC患者的诊断。

本文也比较了抗-Sp100阴性和阳性PBC患者的相关临床资料，结果显示这两类患者在年龄和生化指标以及病理分期方面差异无统计学意义(P＞0．05)，但在免疫学指标中IgG的水平阳性患者高于阴性患者(P＜0．05)。抗-Sp100能否作为判断PBC患者病情及预后的有效指标，还有待于收集整理更多的患者资料进行细致而长期的临床观察。本研究结果提示在PBC病变的早期(Ⅰ/Ⅱ)抗-Sp100阳性率跟晚期(Ⅲ/Ⅳ)无差异(P＞0．05)，揭示了抗-Sp100是在PBC的病变早期时即已经存在。

本研究显示，抗核抗体在PBC中的阳性率较高，实际操作中可作为PBC的初筛实验;另外其在PBC中以核膜型为主，而着丝点型次之，临床医疗工作中，若其ANA结果呈现高滴度的核膜型，可作为一个提示，提醒临床医生检测抗线粒体，来判断此患者体内是否有抗线粒体抗体存在，从而为PBC的早期诊治提供依据。

1 Kaplan MM．Primary biliary cirrhosis．N Engl J Med，1996，335:1570-1580．

2 Worman HJ，Courvalin JC．Antinuclear antibodies specific for primary biliary cirrhosis．Autoimmun Rev，2003，2:211-217．

3 邵杰，魏来，王豪，等．原发性胆汁性肝硬化患者中多核点型核抗体的检测．世界华人消化杂志，2005，13:1478-1481．

4 Heathcote EJ．Management of primary biliary cirrhosis．The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines．Hepatology，2000，31:1005-1013．

5 Vitali C，Bombardieri S，Jonsson R，et al．Classification criteria for Sjogren＇s syndrome:a revised version of the European criteria proposed by the A-merican-European Consensus Group．Ann Rheum Dis，2002，61:554-558．

6 Alvarez F，Berg PA，Bianchi FB，et al．International Autoimmune Hepatitis Group Report:review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis．J Hepatol，1999，31:929-998．

7 Ludwig J，Dickson ER，McDonald GS．Staging of chronic nonsuppurative destructive cholangitis(syndrome of primary biliary cirrhosis)．Virchows Arch A Pathol Anat Histol，1978，379:103-112．

8 Szostecki C，Krippner H，Penner E，et al．Autoimmune sera recognize a 100 kD nuclear protein antigen(sp-100)．Clin Exp Immunol，1987，68:108-116．

9 Szostecki C，Guldner HH，Will H．Autoantibodies against“nuclear dots”in primary biliary cirrhosis．Semin Liver Dis，1997，17:71-78．

10 Luettig B，Boeker KH，Schoessler W，et al．The antinuclear autoantibodies Sp100 and gp210 persist after orthotopic liver transplantation in patients with primary biliary cirrhosis．J Hepatol，1998，28:824-828．

11 Muratori P，Muratori L，Gershwin ME，et al．＇True＇antimitochondrial antibody-negative primary biliary cirrhosis，low sensitivity of the routine assays，or both．Clin Exp Immunol，2004，135:154-158．