马桑提取物促进大鼠烧伤创面愈合的作用和机制*

黄德彬， 胡泽华， 余昭芬， 刘可云

烧伤是最常见的损伤性疾病之一［1］。当今对于Ⅱ°烧伤创面治愈最有价值的治疗方法就是用药物等方法控制感染和促进上皮再生，如最流行的治疗烧伤的10%磺胺脒隆软膏、1%磺胺嘧啶银霜以及聚维酮碘乳膏等［2］。马桑提取物(Coriaria sinica Maxim extract，CSME)是马桑科(Coriariaceae)植物的水提取物，其主要成分为马桑毒素(coriamyrtin)、羟基马桑毒素(tutin)、马桑宁(corianin)等［3］。马桑水提取物有抗惊厥、抗感染、杀虫、清热解毒和生肌等功效，在我国民间常作为草药用于治疗精神分裂症、风湿麻木、牛皮癣、烧伤以及经久不愈的皮肤溃疡等［3-4］。而目前对于马桑提取物治疗烧伤创面愈合效果的研究未见报道，因此，我们研究了其对大鼠皮肤Ⅱ°烧伤模型的治疗效果和初步机制。现报道如下。

材料和方法

1 材料

1.1 材料与试剂 马桑原生植物，九月采伐两年生枝条，经过植物学家鉴别。磺胺嘧啶银软膏(silver sulfadiazine，SSD;山东健康药业有限公司);硫化钠和白凡士林(white petroleum jelly，WPJ;杭州恒润有限公司);苦味酸、甲醛溶液、盐酸、乙酸、生理盐水和乙醇(购于天津科密欧化学试剂有限公司);盐酸替来他明和盐酸唑拉西泮(山东中亚药业有限公司);丙二醛(malondialdehyde，MDA)放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所，No.20101020);大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)ELISA定量试剂盒购于上海源硕生物技术有限公司，Sigma产品;Trizol试剂(100 mL/瓶，Dako);RT-PCR 试剂盒(Roche)。

1.2 仪器 EG1150-H石蜡包埋机、RM2245切片机和DM2000显微镜(德国徕卡);Pharmacia Gene Quant II型RNA/DNA检测仪(Pharmacia Gene Quant Pro);S-450D超声波细胞破碎仪(美国PhD国际科技有限公司);TP600型PCR基因扩增仪(TaKaRa);3K30型低温高速离心机(Sigma);F200酶标仪(瑞士帝肯);DHV-1201-X恒温箱、精密移液器、一次性吸头和YLS-5Q烫伤仪(天津科技发展有限公司);乙二胺四乙酸管 (BD Vacutaine，Becton Dickinson Inc.)。

1.3 cDNA合成引物 Ⅰ型前胶原蛋白cDNA上游引物5'-AGGGACACAGAGGTTTCAGTG-3'，下游引物5'-ACCATTGGCACCTTTAGC-3'，扩增片段 420 bp;βactin上游引物5'-CCCATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'，下游引物 5'-GGCAGGGATGATGTTCTGGAGAGCC-3'，扩增片段长度 410 bp［5］。

2 方法

2.1 马桑提取物软膏的制备 取1 kg马桑枝条粉碎成粉末，作为提取样品，将样品用1 000 mL蒸馏水浸泡30 min后，煎煮90 min分别提取3次，将3次提取物合并、过滤和浓缩至100%的马桑提取浸膏，1 mL浸膏相当于10 g生药。随后，按CSME与普通医用白凡士林10∶2比例混合成外用烧伤软膏。

2.2 药物敷料的制备 药物敷料包括马桑提取物软膏敷料(CSME-dressing)、磺胺嘧啶银软膏敷料(SSD-dressing)和白凡士林软膏敷料(WPJ-dressing)。CSME-dressing和 WPJ-dressing就是将 CSME和WPJ分别用平板电炉加热灭菌后，均匀涂抹于1块无菌敷料上而制得。同样地，不用加热直接制得SSD-dressing。所有药物敷料分别含相应药物大约0.5 g/cm2。

2.3 烧伤动物模型制造与治疗 SD雄性大鼠(6周，180～220 g)来源于重庆医科大学实验动物中心(中国重庆，No.41110252)，在温度(24 ±3)℃和湿度(50±5)%状态下，自由适应12 h阳光与阴影的昼夜节律1周。随机将动物分成对照组(NS)、白凡士林组(WPL)、磺胺嘧啶银组(SSD)、马桑提取物组(CSME)，每组10只。常规配方饲料喂养和自来水饮水。所有动物都保持在昼夜周期(12 h光照，12 h黑暗)的标准实验室条件下的动物房内，温度为(24±3)℃。自由摄取食物和水。动物治疗严格按照国家卫生实验动物护理和使用指南进行。在学院实验动物管理委员会的监督下进行实验。将大鼠腹腔注射2 mL/kg替来他明－唑拉西泮麻醉(Zoletil®，替来他明125 mg/5 mL+唑拉西泮125 mg/5 mL)。检查动物状况后，用电剪剪去背部毛约4 cm ×4 cm范围，而后将剪毛区域用8%硫化钠脱毛，且用75%乙醇消毒。用恒温恒压烫伤仪加500 g压力烫伤脱毛区15 s(2.5 cm × 2.5 cm，90℃)。24 h后取创面组织切片，经HE染色证实为深Ⅱ度烫伤，烫伤动物模型制成备用。之后，各组动物创面分别用NS敷料、WPJ敷料、SSD敷料和CSME敷料覆盖治疗，每天更换药物敷料2次。总共治疗21 d。

2.4 观察内容 在第1 d、3 d、7 d 、14 d、21 d 观察各组动物临床症状和创面状况，如创面色泽、大小、渗出物、结痂及被毛等。此外，测量创面上皮化率(epithelization rate，ER)，包括原始创面面积(primordial area，PA)和未愈创面面积(no healing area，NHA)。计算方法是:ER(%)=(PA-NHA)/PA×100%。

2.5 组织学研究 分别于烧伤后第1 d、3 d、7 d、14 d和21 d取出创缘3、6、9和12时点的创基组织(头尾方向分别为12和6时点，包括部分正常组织)，一部分放入液氮中用于细胞因子检测，另一部分用10%甲醛溶液固定，薄片组织石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察，评价组织改变情况。

2.6 MDA含量与SOD活性测定 先用匀浆机将创基组织匀浆，取上清液样品，严格按试剂盒说明书检测MDA和SOD活性，在波长586 nm检测吸光度(A)。

2.7 创面组织表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，bFGF)蛋白水平的检测 分别称取各组创基组织置于玻璃匀浆器内，按每1 mg组织加1 mL蛋白提取液稀释后，用匀浆机匀浆200次，将匀浆液置于40℃恒温箱30 min后，吸取匀浆液置于离心管中12 000 r/min离心20 min。取上清液分析细胞因子的表达，如EGF和bFGF，相应地按ELISA试剂盒说明书进行分析。在波长450 nm检测吸光度(A)，检测上限分别是80 ng/L和100 ng/L。

2.8 创面Ⅰ型或Ⅲ型胶原mRNA表达的检测 用PCR级器械留取创基组织样品，迅速保存在－80℃冰箱内备用。分别将样品用DNA/RNA测定仪测定波长为A260/A280吸光度值(在1.8～2.0范围内)与RNA浓度。用RT-PCR一步法完成mRNA扩增和检测。将蛋白cDNA引物上、下游设计跨2个外显子。为保证mRNA扩增的稳定性和特异性，以500 bp扩增片段作为推荐长度。设置阴性对照和内对照组，以便排除RNA非特异性扩增和降解所导致的误差。为确定各待测模板样品指数增长期的起始拷贝数，设置3个数量级的标准对照，制备标准曲线，测定mRNA的表达值。

3 统计学处理

用SPSS 11.0软件。数据用均数 ±标准差(Mean±SD)表示，均数比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CSME对烧伤大鼠创面愈合的影响

烧伤后第1 d和3 d，各组创面临床症状和ER相当，无显著差异(P＞0.05);在第3 d，CSME组中少数动物创面中央颜色暗红。第7 d，各组创面ER相当，无显著差异(P＞0.05)，NS和WPJ组创面湿润呈暗红色结痂，少数动物创面有微量渗出液。但CSME和SSD组创面干燥呈褐色结痂，无渗出液，在CSME组中少数动物创缘有脱痂之趋势。

第14 d，各组创面干燥呈褐色或黑色结痂，创面开始缩小;SSD组创缘开始脱痂，创缘新生上皮生长活跃，有少量新生被毛生长，创面中央渗液少，其ER明显高于NS和WPJ组(P＜0.05);CSME组创缘明显有脱痂，新生上皮生长高度活跃，有大量新生被毛生长，创面中央渗液少，其ER明显高于SSD组(P＜0.05);NS和 WPJ组无脱痂之势，ER相当 (P＞0.05)，创面中央渗液明显多于SSD和CSME组。

第21 d，NS和WPJ组创面中央尚有少许未脱落的黑色结痂［(0.42 ±0.08)cm2和 (0.47 ±0.06)cm2］，ER 为83.14% ±2.33%和 81.09% ±3.12%，创面周围大部分被新生上皮覆盖，有大量被毛生长;SSD与CSME组创面完全愈合，ER为98.67% 和100%。其中，SSD组创面中央新生被毛稀疏而细小，而CSME组创面中央被毛密集，大部分被毛接近正常，见图1。

Figure 1.Effects of CSME on ER of burn wounds in rats.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05 vs SSD group.△P ＜0.05 vs NS or WPJ group.图1 CSME对大鼠烧伤创面ER的影响

2 CSME对烧伤创面组织学的影响

第1 d和3 d，各组病理学观察相当。伤后第7 d，各组创面组织学检查结果稍有不同。在NS和WPJ组中，病理学观察相当;其真皮层充血、水肿明显，纤维中有大量炎症细胞浸润;胶原纤维显著肿胀、融合，原纤维结构消失;表皮细胞缺如，组织生长不明显;大量组织细胞变性坏死，绝大多数细胞浆浓缩，细胞核固缩。在SSD组中，可见真皮层充血、水肿较轻，纤维中有较多炎症细胞浸润;胶原纤维肿胀，离散与融合交替，原纤维结构少量残存;表皮细胞缺如，组织生长不活跃，中等量的组织细胞变性坏死，半数细胞浆浓缩，细胞核固缩。在CSME组中，可见真皮层充血、水肿轻微，纤维中有少数炎症细胞浸润;所有胶原纤维轻微肿胀，无融合，原纤维结构残存较多;有少数表皮细胞，组织生长较活跃，有少数组织细胞变性坏死，少数细胞浆浓缩，细胞核固缩。

第14 d，各组创面组织学检查结果明显不同。NS组与WPJ组大致相当:外围有小范围坏死组织溶脱，少数肉芽组织裸露;可见真皮层轻度充血、水肿，纤维中有少量炎症细胞浸润;少数胶原纤维轻度肿胀、融合，原纤维结构完整;创面外围表皮细胞有限覆盖，上皮组织生长活跃，少数组织细胞变性坏死，无细胞浆浓缩和细胞核固缩。在SSD组中，创面外围有部分坏死组织溶脱以及肉芽组织裸露;真皮层无充血、水肿，有少量白细胞浸润;胶原纤维无融合，原纤维结构完整;外围表皮细胞广泛覆盖，上皮组织生长活跃，有少数组织细胞变性坏死，无细胞浆浓缩与细胞核固缩。在CSME组中，创面外围普遍坏死组织溶脱，肉芽组织裸露;真皮层有个别白细胞浸润，无充血、水肿;胶原纤维结构完整，无肿胀，无融合;外围表皮细胞广泛覆盖，上皮细胞生长极其活跃，无细胞变性坏死、细胞浆浓缩和细胞核固缩。

第21 d，各组创面组织学检查结果有显著差异。在NS和WPJ组中，创面近愈合，中央区域上皮分化差，炎症细胞浸润明显，组织结构不清淅;在SSD和CSME组中，所有创面完全愈合;其中，SSD组创面中央区域被分化良好的单层上皮细胞覆盖;大量胶原纤维增生，不规则排列，组织结构模糊，皮脂腺和毛囊增生活跃;而CSME组镜下可见全部被多层上皮细胞覆盖，新生胶原纤维充分分化，排列整齐，组织结构明朗，皮脂腺和毛囊增生极其活跃等，见图2。

3 CSME对烧伤大鼠创面MDA含量和SOD活性的影响

各组大鼠在烧伤后，从第1 d到21 d，MAD含量逐渐降低，NS、WPJ和SSD组相当，无显著差异(P＞0.05)。在第3 d、7 d、14 d 和21 d，CSME 组的 MDA含量均低于其它各组(P＜0.05)，见表1。

从第1 d到21 d，各组大鼠在烧伤后，SOD活性随时间逐渐增强，NS、WPJ和SSD组相当，无显著差异(P ＞0.05)。在第3 d、7 d、14 d和21 d，CSME 组的SOD活性均强于其它各组(P＜0.01)，见表2。

Figure 2.Effects of CSME on pathological changes of burn wounds in rats on the 21st day(HE staining).图2 CSME对大鼠烧伤第21 d创面病理变化的影响

表1 CSME对烧伤大鼠创面MAD含量的影响Table 1.Effects of CSME on MDA content of burn wounds in rats(mean±SD.n=10)

表2 CSME烧伤大鼠创面SOD活性的影响Table 2.Effects of CSME on SOD activity of burn wounds in rats(mean±SD.n=10)

4 CSME对烧伤大鼠创面EGF和bFGF蛋白水平的影响

烧伤后从第1 d到21 d，各组大鼠EGF蛋白水平为先升高后降低，在第3 d和7 d达最高峰，远高于其它时点(P ＜0.05 或 P ＜0.01)。其中，NS、WPJ和SSD组的EGF水平相当，无显著差异(P＞0.05)。但CSME组在第3 d和7 d的EGF蛋白水平显著高于其它各组，在第14 d和21 d迅速下降，低于其它组(P ＜0.05 or P ＜0.01)，见图 3。

Figure 3.Effects of CSME on protein level of EGF of burn wounds in rats.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs other groups.图3 CSME对大鼠烧伤创面EGF蛋白水平的影响

第3 d，CSME组的bFGF蛋白表达显著高于其它各组，在第7 d、14 d和21 d迅速下降，显著低于其它组(P ＜0.05或 P ＜0.01)，见图4。

Figure 4.Effects of CSME on protein level of bFGF of burn wounds in rats.Mean ±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs other groups.图4 CSME对大鼠烧伤创面bFGF蛋白水平的影响

5 CSME对大鼠烧伤创面Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

第14 d，大鼠正常组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的总含量均显著低于其它组烧伤创面组织(P＜0.05)。对于Ⅰ型胶原mRNA表达，SSD组显著高于其它各组，CSME组显著高于正常组织而低于NS和WPJ组，但Ⅲ型胶原mRNA表达则相反。SSD组Ⅰ型与Ⅲ型胶原mRNA表达的比值显著高于其它各组和正常组织，CSME组显著低于其它各组和正常组织(P＜0.05)，而正常组织、NS组和WPJ组之间无显著差异(P＞0.05)。这表明CSME在抑制烧伤创面Ⅰ型胶原和增强Ⅲ型胶原mRNA表达方面起着重要作用，见图5、表3。

Figure 5.The mRNA expression of typeⅠ andⅢ collagen in normal and scar tissues on the 14th day after burn in rats.图5 大鼠烧伤后第14 d正常和疤痕组织Ⅰ和Ⅲ型胶原mRNA的表达

表3 第14 d CSME对大鼠烧伤创面Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的影响Table 3.Effects of CSME on mRNA expression of typeⅠandⅢcollagen in burn wounds on the 14th day after burn in rats(mean±SD.n=10)

讨 论

目前控制烧伤创面感染、促进创面愈合和抑制病理性瘢痕增生是现代医学的一大难题［6-8］。临床常用的磺胺嘧啶银只能用以控制创面感染，不能促进烧伤创面愈合和抑制创面病理性疤痕增生［9-10］。在中国民间，马桑水提取物被用作治疗经久不愈的皮肤溃疡和烧伤创面愈合［11］。有报道，其对烧伤创面常见感染耐药菌有显著抑制作用［12］。本实验发现，CSME有促进大鼠烧伤创面愈合作用。烧伤后第14 d，CSME组新生上皮生长高度活跃，有大量新生被毛生长，烧伤后第21 d，CSME组创面中央被毛密集，大部分被毛接近正常，创面上皮化速率明显高于SSD组，差异显著(P＜0.05)。

1 CSME影响SOD活性和MDA含量，维护烧伤创面组织细胞的代谢与功能，阻止细胞凋亡

烧伤后，机体通过非酶系统与酶系统产生氧自由基，产生的氧自由基可破坏生物膜的多不饱和脂肪酸，诱发脂质过氧化反应［13-14］。这种脂质过氧化反应可将活性氧转化为非自由基性的脂质产物，通过链式反应放大活性氧作用，产生MDA、羟基、酮基、羰基、氢过氧基等多种脂质过氧化物［15］。其中，MDA能引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合而导致细胞毒性作用，伴随细胞代谢紊乱与功能障碍，甚至凋亡［16］。因此，MDA含量可反映烧伤创面组织脂质过氧化的程度而间接体现细胞损伤的程度。SOD能通过清除氧自由基而阻止其诱发的脂质过氧化反应，保护细胞免受损伤。SOD是机体内清除氧自由基的重要抗氧化酶之一，其活性强弱可直接反映机体清除氧自由基的能力［17］。本研究发现，在第3 d、7 d、14 d和21 d，CSME 组的 MDA 含量低于其它各组，但SOD活性高于其它各组(P＜0.05，P＜0.01)。因此，CSME促进烧伤创面愈合作用与增强SOD活性和抑制MDA的生成、以维护烧伤创面组织细胞的代谢与功能有关。

2 CSME调控烧伤创面EGF和bFGF蛋白水平，缩短创面修复进程和阻止创面疤痕形成

EGF是人体皮肤内与生俱来的物质，其通过多种细胞因子的磷酸化，将生物信息转导至胞内［18］。EGF可增强糖的酵解，通过激活RNA转录、蛋白质与DNA的合成，而促进表皮细胞的增殖分化［15］。有报道，EGF还可增强细胞凋亡抑制基因bcl-2的功能，防止细胞内DNA的断裂，避免细胞变异与凋亡［12］。这说明，烧伤创面组织的EGF含量，能直接体现烧伤创面修复的活跃程度。单拷贝基因bFGF编码155个氨基酸，位于第5对染色体上，是促有丝分裂的阳离子多肽［16］。bFGF与受体结合后，一方面，激活腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶，最终激活蛋白激酶C，同时增加Ca2+内流而发挥生物学效应;另一方面，在细胞核内激活RNA聚合酶Ⅰ，增加核蛋白体基因转录，增强DNA合成，继而促进细胞由G0期向G1期，最终转向S期，增强细胞的有丝分裂［17］，促进组织再生修复、加快创伤愈合，还参与神经再生以及充当血管生长因子等［13］。因此，bFGF在促进烧伤创面修复的同时，对于创面疤痕形成也起着重要作用［18］。本研究显示，烧伤后从第 1 d到 21 d，CSME早期EGF和bFGF表达显著高于其它各组，后期迅速下降，低于其它组(P＜0.05或 P＜0.01)。因此，CSME促进烧伤创面愈合作用，与早期增强EGF和bFGF水平有关，而创面愈合后，在瘢痕形成期则阻止其含量增加，减少瘢痕形成。

3 CSME调控烧伤创面Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达，在促进创面愈合的同时，抑制病理性瘢痕增生

存在于皮肤中的胶原纤维主要为Ⅰ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型胶原纤维粗大，位于真皮浅层，是烧伤创面瘢痕组织纤维化的物质基础。有研究发现，在质地坚硬而无弹性的瘢痕组织中，可见大量Ⅰ型胶原纤维沉着［11］。Ⅲ型胶原纤维细小，主要位于真皮的深层［16］。有报道，在胎儿无瘢痕愈合的多种影响因素中，Ⅰ型胶原纤维含量很低，Ⅲ型胶原纤维含量很高［15］。因此，Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维含量比与烧伤创面无瘢痕愈合呈现负相关［17］。烧伤愈合过程中，一般在第14 d胶原纤维表达最为活跃，与疤痕形成密切相关［12］。本研究发现，在第14 d，创面组织学研究证实，与SSD组相比，CSME组胶原纤维相对细小，分化良好，排列整齐;大鼠正常组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA表达的总含量均显著低于其它组烧伤创面组织(P＜0.05);在Ⅰ型与Ⅲ型胶原mRNA表达的比值方面，SSD组显著高于其它各组和正常组织，CSME组显著低于其它各组和正常组织(P＜0.05)，而正常组织、NS组和WPJ组之间无显著差异(P＞0.05)。这表明CSME在抑制烧伤创面Ⅰ型胶原而增强Ⅲ型胶原mRNA表达方面起着重要作用，其在促进烧伤创面愈合的同时，也通过调控Ⅰ型与Ⅲ型胶原mRNA表达比值而阻止病理性瘢痕的过度增生。

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