酒醅微生物DNA提取预处理方法研究

沈才萍，李德林，沈才洪，3，邓 波，3，沈小娟，3，敖宗华，，3

(1.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000;2.四川理工学院生物工程学院，四川 自贡 643000;3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000)

引言

运用分子生物学相关方法对固态酿造食品中微生物进行分子生态分析。不仅能克服经典培养方法对微生物群落结构特征信息研究丢失的局限，还可以更加可靠、快速地获得发酵过程中各种微生物的菌落指纹特征，确定微生物的多样性及其分类地位。对食品发酵进行微生物分子生态研究，首先是需要获得高质量微生物总DNA。所以，发酵食品微生物总DNA提取是进行后续分子生物学研究的第一个技术难点。能否快速成功获得样品的总DNA，获得的总DNA质量的高低直接影响整个后续实验的成败［1］。在富含多糖、盐、淀粉、腐殖酸和代谢色素酚等杂质的酒醅环境中提取微生物总DNA，这些杂质不易与DNA样品分离，而它们的存在会抑制DNA聚合酶活性，导致后续分子生物学实验失败。

环境样品总DNA预处理方法可概括为两类:直接法和间接法，直接法是先用溶液溶解样品中的杂质，通过反复离心等方法获得样品沉淀，该操作能除去环境样品中水溶性杂质，还能减少微生物在预处理中的丢失;间接法提取是通过梯度离心、离心洗涤等步骤出去样品杂质，然后再收集菌体，该过程容易造成微生物种类和数量的丢失，但能够得到较高质量的DNA。根据环境样品的差异采用合适的预处理方法，能够保证实验的顺利进行。在此，本实验研究了不同预处理方法，以获得一种适合酒醅环境中微生物总DNA提取预处理的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

酒醅样品采集于泸州老窖罗汉基地浓香型白酒窖池。取样后迅速置于-80℃冰箱保藏，备用。

1.2 主要试剂与仪器

试剂:蛋白酶k(上海生工生物工程技术服务有限公司)、无菌水、TENP缓冲液、PBS缓冲液。

仪器:PCR仪(美国BIORAD)、DGGE电泳仪(美国BIORAD)、高速离心机(日本HITICHI)、核酸蛋白检测仪(德国Eppendorf)。

1.3 酒醅预处理

称取0.5 g酒醅样品于50 mL离心管，分别按照下面方法进行。

方法A(无菌水):离心管加入3 mL无菌水和0.3 g玻璃珠，漩涡震荡5 min，10 000 rpm离心5 min，弃上清。在沉淀中加入3 mL无菌水重复上述操作2次，取沉淀。

方法B(TENP):离心管加入3mL TENP缓冲液和0.3 g玻璃珠，漩涡震荡5 min，10 000 rpm离心5 min，弃上清。在沉淀中加入3mL TENP缓冲液重复上述操作2次，取沉淀。

方法C(PBS):离心管加入3 mL PBS缓冲液和0.3 g玻璃珠，漩涡震荡5min，200×g离心5 min，吸取上清液。在沉淀中加入3 mL PBS缓冲液重复洗涤两次，合并三次上清液，12 000 rpm离心5 min，取沉淀。

1.4 DNA的提取和纯化［2］

预处理后的沉淀中加入1 mL DNA抽提液(100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L EDTA，100 mmol/LNa3PO4，1.5 mol/L NaCl)和5μ蛋白酶k(20 mg/mL)，200 r/min摇床37℃下30 min，在加入500μL 10%SDS 65℃水浴1 h。水浴后的样品4℃下6000×g离心10 min，小心吸取上清于2 mL离心管，加入等体积酚氯仿异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，12 000 rpm离心10 min，取上清加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)12 000 rpm离心10 min，取上清，重复两次。上清液加入0.6体积预冷的异丙醇-20℃沉淀1 h，12 000 rpm离心10 min，小心倒掉液体。沉淀用70%乙醇洗涤数次。洗涤后的DNA用吹风吹干后TE溶解，-20℃保存。

1.5 DNA核酸蛋白仪检测

提取的DNA样品在核酸蛋白仪中测其OD230、260、280、340及OD260/280、OD260/230。

1.6 细菌v3区PCR

(1)引物:16S rDNA V3区PCR扩增所用的引物采用Muzyer等人所用的引物，可以扩增16S rDNA V3区约196bp的片段，对应E.coli16S rDNA 341到534的位点。在片段的一端加了富含GC的片段(GC clamp)，序列如下:

(2)PCR反应体系及程序:PCR反应需进行两轮，第一轮反应体系为25μL:0.2μL Taq酶(5 u/μL)，2 μL dNTPs(2.5 mM)，2.5μL10×buffer，引物(10 pM)各1μl，模板DNA(10 ng)，18.3μL灭菌双蒸水。程序:94℃预变性4 min;94℃变性1 min，应用降落PCR，65℃开始退火，每两轮降低1℃，最终降至56℃，退火1min，72℃延伸1 min;再94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共10个循环，72℃终延伸6 min。第二轮PCR反应(50μL):0.5μl Taq酶(5 u/μL)，4μL dNTPs(2.5 mM)，5μL10×buffer，引物(10 pM)各1μl，第一轮PCR产物模板DNA(5μL)，33.5μL灭菌双蒸水，94℃预变性3 min，94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共10个循环，终延伸72℃10 min。两轮PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离检验，电压约11 V/cm，电泳时间20 min，凝胶成像系统照相。

1.7 DGGE电泳

DGGE电泳条件:8%聚丙烯酰胺凝胶，DGGE采用30%～50%变性梯度(100%变性剂浓度为7 M尿素，40%甲酰胺)，上样量为80 uL的PCR产物。电泳缓冲液为1×TAE，60℃，200 V电压电泳3.5 h，SYBR GreenⅠ染色45 min，凝胶成像系统拍照。

2 结果与分析

2.1 核酸蛋白仪检测结果分析

蛋白核酸定量检测仪测定三种方法所提总DNA在280 nm、260 nm与230 nm下光吸收值，并以A260/A280与A260/A230分析DNA纯度，根据DNA浓度换算出每克酒醅样品中DNA含量。每种方法重复4次独立实验(n=4)，DNA浓度与DNA提取量以4次重复试验的表示。P≤0.01表示具有显著差异。实验数据用STATA统计软件分析完成。结果见表1。

表1 不同预处理方法提取DNA比较

从表1结果可以看出三种预处理方法均得到较高浓度的DNA，其中无菌水处理的样品平均值达到95.725±2.804μg/mL，其次是PBS处理样品平均值为66.375±4.224μg/mL，浓度最低为TENP处理样，其平均值为56.475±9.601μg/mL。从获得DNA浓度分析，无菌水处理样品明显高于其余两种方法，而PBS缓冲液和TENP缓冲液处理样DNA浓度差别不大。其原因可能由于TENP中的PVP与酒醅中的腐殖酸、酚类物质结合的时候，少量DNA分子也结合在一起，留在上清液中，造成DNA的损失。PBS处理是通过多次悬浮细胞来获得菌体，由于少量细菌与酒醅结合在一起，振荡后少量菌体仍留在酒醅中而损失。

DNA的纯度可通过A260/A280比值表示，比值在1.8～2.0说明DNA纯度较好，比值低于1.8说明样品DNA存在蛋白质污染，比值高于2.0说明样品存在RNA污染。样品杂质的含量可以通过A260/A230比值来确定，即比值越高，杂质含量越低。无菌水、TENP、PBS三种预处理方法获得的DNA样品A260/A280平均值分别为1.645±0.045、1.535±0.047和1.855±0.024。其中无菌水和TENP处理样低于1.8，说明样品中存在蛋白质污染。无菌水处理样品虽然DNA浓度较高，但各种杂质含量也是最高的，反映出DNA浓度越高其杂质含量也就越多，原因可能是杂质与DNA分子之间存在相互结合，其机理还未见相关报道，有待进一步研究。TENP缓冲液中的PVP可以和苯酚基化合物形成氢键，国内外大部分方法也应用PVP或是不溶性的聚乙烯聚吡咯烷酮去除腐殖酸［3-4］。从数据中可以看出用TENP处理样品OD A340较低，说明TENP对去除样品中的酚、腐殖酸有一定的效果。经过PBS处理的样品，经过高速离心后，大量杂质都沉淀下来，从而获得较纯净的菌液悬浮。

2.2 PCR扩增分析

图1为第一轮PCR产物电泳图，图2为以第一轮PCR扩增产物为模板电泳图，三种预处理方法均在预测大小片段200 bp处有目的条带，扩增片段越清晰，条带越明亮，扩增出目的DNA浓度越高。无菌水与TENP处理的样品条带较暗，PBS处理后的样品，均有较亮条带，说明PBS方法能较好的扩增出目的基因。

DNA模板中腐殖酸的存在，可以螯合Mg2+也可与DNA、蛋白质发生共价结合，从而抑制Taq酶的活性［5］。模板中蛋白质存在会阻碍引物与模板的结合，影响PCR扩增。无菌水样品虽然DNA浓度较高，但杂质含量也高，从图1、图2看出，杂质较高的无菌水和TENP处理的样品，其扩增目的DNA条带较暗，证明了DNA模板中杂质会影响PCR扩增。PBS处理样品中DNA浓度不高，但杂质含量较低，其扩增条带明亮，能很好的扩增目的基因片段，说明经过该方法处理后获得的酒醅微生物DNA，适合进行后续的操作。

2.3 V3区扩增片段DGGE分析

PCR-DGGE用于微生物群落结构的分析，一般要求目的片段在500 bp以下，对细菌群落的分析通常采用16S rRNA V3区片段［6-7］。根据DGGE能分离长度相同而序列不同DNA的原理，图谱中不同条带代表不同的细菌，电泳条带越多表明分离的细菌种属越多，条带亮度越强表示该条带代表的相应细菌数量越多［8-9］。三种预处理方法获得的DGGE图谱(图3)中条带的位置和数目均有差异，有的条带位置相同但亮度(粗细)不同，对应其在DGGE梯度胶上的密度大小不同，有的条带在DGGE梯度胶上出现的位置不一样，有的则显示空缺。无菌水处理的样品有五条明显条带且条带亮度较暗，TENP和PBS处理样品获得的DGGE图谱具有相近的条带数、条带位置及相对丰度，表明两种方法获得的基因组DNA中菌群结构相似性较高。图像图谱分析表明PBS处理方法侦测条带最高(Int值最高)，TENP处理方法次之，无菌水处理方法条带最少。将三种方法处理的样品获得的相同优势条带进行峰面积积分(表2)。其中PBS处理方法获得的各条带清晰度最高。

图3 细菌16SrDNA V3区扩增片段DGGE图谱

表2 细菌16SrDNA V3区扩增片段DGGE指纹图谱峰面积积分

3 讨论

本实验在三种预处理方法基础上，采用SDS高盐+蛋白酶K的方法提取得到酒醅中的微生物总DNA。实验分析发现，DNA样品中的杂质会严重影响PCR扩增，且DNA中杂质含量与DNA浓度成正相关，DNA浓度越高其杂质含量也高。无菌水和TENP处理的样品在PCR第一轮和第二轮中扩增出条带较暗，最终DGGE图谱条带数目与亮度也较差。PBS处理的样品能很好的扩增出目的基因，DGGE图谱分析及相似性分析均表明PBS处理方法较佳，通过PBS处理方法获得的基因组DNA其DGGE图谱中条带明亮、丰度高，能很好反映样品细菌的多样性，有利于相关分子生物学分析。

分子生物学广泛应用于酒醅微生物生态学研究中［10］，如用于构建环境微生物基因库，用于动态分析群落变化规律以及微生物酿酒环境关系研究等。如何快速高效提取适于进一步分子生物学操作的微生物总DNA的方法成为关键技术。对酒醅样品进行预先处理，是一种简单有效的方法，能有效地去除大量杂质，保证后续分子生物学实验的顺利进行。本文比较了三种不同预处理方法，最终确定了PBS处理法为酒糟最佳预处理方法，可用于酒醅环境中细菌基因组DNA的提取。

［1］杨模华，李志辉.马尾松针叶DNA提取方法研究［J］.中南林业科技大学学报，2008(3)：39-44.

［2］倪峥飞，许 伟，窦文芳.镇江香醋固态发酵醋醅中微生物总DNA提取方法比较［J］.微生物学报，2010(1)：119-125.

［3］Muyzer G，Waal E，Uitterlinden A.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gelelectrophores analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA［J］.Applied and Environm entalMic robiology，1993，59：695-700.

［4］Berthelet M，Whyte L，Greer CW.Rapid direct extra of DNA from soils for PCR analysis using polyvinylpoly pyrrols p in columns［J］.FEMSMicrobiol Lett，1996，138：17-22.

［5］Zhou J，Bruns M，Tiedje A.DNA recovery from soils of diverse composition.Appl Environ Microbiol［J］.1996，62：316-322.

［6］李钧敏，金则新.一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法［J］.应用生态学报，2006(11)：2107-2111.

［7］文亚峰，何 刚.枣叶片DNA的提取以及AFLP反应体系的建立［J］.中南林业科技大学学报，2007(3)：25-28.

［8］常月梅.核桃总DNA提取方法研究［J］.经济林研究，2006(3)：38-39.

［9］魏 勇，王红宁.PCR-DGGE技术用于猪场沼气池细菌群落分析的条件优化［J］.农业环境科学学报，2011(3)：599-604.

［10］卫春会，黄治国，甄 攀.窖泥微生物群落SSCP分析条件优化的研究［J］.四川理工学院学报：自然科学版，2010，23(6)：695-698.