精原细胞瘤中T 淋巴细胞亚群表达及临床意义

牛忠杰，畅继武

（天津医科大学第二医院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

精原细胞瘤是睾丸最常见的恶性肿瘤，肿瘤间质中伴有较多淋巴细胞浸润。笔者采用免疫组织化学方法对72例精原细胞瘤间质中浸润的淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD25 的表达情况进行检测，研究肿瘤中细胞免疫情况。

1 资料和方法

1.1 临床资料 72例患者均为1988-2012年于本院住院行手术治疗的患者，均经病理证实为精原细胞瘤，所有患者术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗。经典型精原细胞瘤51例，临床I 期38例，II 期13例；间变型精原细胞瘤21例，临床I 期13例，II期8例；患者平均年龄24～67 岁，中位年龄43 岁。病变的睾丸左侧30例，右侧42例。

1.2 方法

1.2.1 切片 肿瘤组织常规石蜡包埋后，每个标本连续切取4μm 厚白片4 张，分别进行CD3、CD8、CD4 及CD25 染色。

1.2.2 主要试剂 鼠抗人CD3 单克隆抗体，兔抗人CD4 单克隆抗体，兔抗人CD8 单克隆抗体，鼠抗人CD25 单克隆抗体及通用型PV6000 HRP 多聚体二抗均购自中杉金桥公司。

1.2.3 免疫组织化学染色步骤 应用免疫组织化学SP 法染色。石蜡切片常规脱蜡和水化后,使用微波炉修复，恢复室温后用PBS 洗涤；使用3%H2O2封闭内源性过氧化物酶；PBS 洗涤；滴加一抗，放入4℃冰箱孵育过夜；PBS 洗涤；滴加二抗试剂，室温下孵育20 min；PBS 洗涤；DAB 显色，显微镜下观察并终止显色；自来水冲洗；苏木素复染；梯度乙醇脱水；二甲苯透明及中性树胶封片。

1.3 结果判读 CD3+、CD4+、CD8+、CD25+T 细胞判断标准：细胞形态完整，结构清晰，细胞膜上有棕黄色颗粒附着,如图1～4。连续切片中，在相同部位出现CD4、CD25 阳性标记的细胞即为调节性T 细胞（T regulatory，Treg）。采用盲法进行观察，先用低倍镜观察整张切片，每张玻片随机选择10个高倍视野（400×）计数阳性细胞，并且求平均值。

1.4 统计学方法 应用SPSS15.0 统计软件对数据进行处理。对CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、Treg 的分组计量，结果以±s 形式表示。以t 检验方法对数据进行检验，检验水准取α=0.05。

2 结果

2.1 T 淋巴细胞亚群在不同分期的经典型精原细胞瘤中表达 相比较于I 期，II 期患者的CD3+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞及CD4+/CD8+比值均下降，差异有统计学意义（P<0.05），CD8+T 淋巴细胞及调节性T 淋巴细胞数值均升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 经典型精原细胞瘤间质中T 淋巴细胞亚群活性比较Tab 1 Comparison of the result of T cell subtypes among different stages of classical seminoma

2.2 T 淋巴细胞亚群在不同分期的间变型精原细胞瘤中表达 研究结果显示，间变型精原细胞瘤随肿瘤进展，肿瘤间质中CD3+T 淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞及CD4+/CD8+比值都下降，差异有统计学意义（P<0.05），而CD8+T 淋巴细胞及调节性T 淋巴细胞则升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 间变型精原细胞瘤间质中T 淋巴细胞亚群活性比较Tab 2 Comparison of the result of T cell subtypes among different stages of anaplastic seminoma

3 讨论

肿瘤的发生、发展不仅是肿瘤细胞内在的特性反应，而且与肿瘤微环境中的非肿瘤成分有一定关系[1-2]。非肿瘤成分中的免疫细胞在肿瘤进展中发挥一定作用。据肿瘤免疫编辑学说，肿瘤细胞在机体内发生、发展是一个免疫系统与肿瘤细胞相互作用的动态过程，当机体免疫能力降低，不能有效清除、抵制肿瘤细胞时，肿瘤会加速生长[3]。肿瘤免疫以细胞免疫为主，其中T 细胞发挥主要作用。T 细胞通过各个亚群之间的协同作用发挥效应，随肿瘤进展，受多种因素影响，免疫系统中T 细胞亚群失衡，造成机体对肿瘤的免疫耐受。

T 细胞亚群中的CD4+T 细胞不仅可以激活肿瘤特异性细胞毒性T 淋巴细胞，还可活化免疫系统中其他效应细胞如B 细胞、巨噬细胞等，从多方面增强细胞免疫，诱导多种效应细胞杀伤肿瘤细胞，调节免疫反应的活性。Perdz-Diez 等[4]研究显示在小鼠B6 膀胱癌模型中，肿瘤特异性CD4+T 细胞发挥比CD8+T 细胞更重要的抗肿瘤效应。在本研究中，II 期患者，CD4+T 细胞数量与I 期相比明显减少（P<0.05），提示精原细胞瘤间质中，抗肿瘤免疫效应降低。CD8+T 淋巴细胞可以特异性直接杀伤肿瘤细胞，精原细胞瘤，无论是经典型精原细胞瘤还是间变型精原细胞瘤，II 期患者标本中CD8+T 细胞数目有所增加（P<0.05），这与Hadrup 等[5]的研究结果一致，但肿瘤间质中的CD8+T 细胞能否发挥有效的细胞毒作用还有待进一步研究。精原细胞瘤间质CD4+T/CD8+比值降低，II 期精原细胞瘤CD4+T/CD8+比值降低更加明显，提示T 细胞介导的免疫抑制加重。肿瘤间质中T 淋巴细胞数量异常，各亚群比例失衡，改变了组织局部免疫微环境，免疫功能减弱，有利于肿瘤细胞增殖。调节性T 细胞是一群具有免疫负调控能的T 细胞亚群，可通过分泌IL-10、转化生长因子-β 及细胞接触等多种方式发挥作用[6]。Liyanage[7]检测乳腺癌、胰腺癌和正常人的外周血淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和肿瘤区域淋巴结中Treg 的比重发现，癌症患者体内Treg 显著高于正常人，而在TIL、区域淋巴结中Treg 比重分别为20.2%和20.1%。本研究结果提示，在精原细胞瘤中也能见到Treg 散在分布，且随着精原细胞瘤肿瘤临床分期进展，肿瘤间质中Treg 细胞数量增多，Treg 的浸润也在一定程度上反应了机体的肿瘤免疫受到抑制。

近年来，肿瘤的免疫治疗包括肿瘤疫苗以及TIL细胞过继免疫治疗已经过大量的试验，但其抗肿瘤作用仍有限。研究表明，通过去除机体Treg 细胞可以提高肿瘤疫苗的抗瘤效应，进一步了解Treg 细胞调节机制可能会提供更有效的抗肿瘤免疫疗法。

［1］Hanahan D,Weinberg R A.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144（5）:646

［2］Pollard J W.Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis[J].Nat Rev Cancer,2004,4（1）:71

［3］Dunn G P,Bruce A T,Ikeda H,et al.Cancer immunoediting：from Immuno-surveillance to tumor escape[J].Nat Immunol,2002,3（11）：991

［4］Perez-Diez A,Joncker N T,Choi K,et al.CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells [J].Blood,2007,109（12）：5346

［5］Hadrup S R,Braendstrup O,Jacobsen G K,et al.Tumor infil-trating lymphocytes in seminoma lesions comprise clonally expanded cytotoxic T cells[J].Int J Cancer,2006,119（4）:831

［6］Nishikawa H,Sakaguchi S.Regulatory T cells in tumor immunity[J].Int J Cancer,2010,127（4）:759

［7］Liyanage U K,Moore T T,Joo H G,et al.Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma[J].J Immunol，2002，169（5）：2756