HPLC法测定龙胆泻肝丸中栀子苷的含量

姚鸿雁 席璐

龙胆泻肝汤方剂出自清·汪昂《医方集解》，是由龙胆、栀子、黄芩、泽泻等十味药制成，为古今临床常用方剂，具有清肝胆，利湿热等功效，主治肝胆实火上扰［1］，对头晕头痛、耳鸣耳聋、眼底出血、淋证阴痒、赤白带下、不孕症、泄泻、带状疱疹等各病，临床验之确有疗效［2］。该方的特点为泻中有补，降中寓升，去邪而不伤正，泻火而不伐胃［3］。方中龙胆为君，栀子、黄芩为臣。本方临床应用广，疗效卓著，且剂型较多，而文献中的含量测定多是测定其君药成分，如《中国药典》2005版一部收载了龙胆泻肝水丸中的龙胆苦苷的含量，由于栀子也是本方的主要药物，且栀子苷为其主要的药理活性成分之一，本研究建立的方法可测定栀子苷的含量，方法可靠、快速，可较好地用于控制该类制剂的质量，为院内制剂质量控制提供可靠的检验标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Shimadzu LC-10ATvp型高效液相色谱仪(自动进样器SIL-20A，输液泵LC-10ATvp，检测器SPD-M10AVP)，工作站CLASS-VP V6.14 SP1;赛多利CP225D电子分析天平(德国);AEL-200电子分析天平(湘仪天平仪器设备有限公司);AP-01P型真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);色谱柱:Agilent XDB-C18 柱(4.6×150 mm 5μm)。

1.2 试药 栀子苷对照品 (110749-200410，中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯，水为纯化水，龙胆泻肝丸 (自制:批号 SY1001、SY1002、SY1003)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为 Agilent C18柱(5 m，4.6 mm×250 mm);柱温为40℃;流动相为甲醇-水(23∶77);体积流量:1.0 ml/min;检测波长:238nm;进样量:5 l。

2.2 对照品溶液制备 精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.0831 mg/ml的对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 参考药典中的方法［4］。因药典方法中规定超声提取的条件为功率250W、频率为33kHz、超声45 min，但实验室超声设备的频率与之不同，故对超声时间做一考察。分别选择超声35 min、45 min、55 min所制得样品进行测定指标成分峰面积，分别测定3次，结果显示，峰面积均数随超声时间延长而增大，而通过t检验发现，超声45 min效果较35 min有极显著性差异(P＜0.01)，而超声55 min峰面积均数虽较45 min大，但差异没有显著性(P＞0.05)。为节省分析时间，故选择超声45 min。

取龙胆泻肝丸，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率50KHz)45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备 参考药典中的方法，按处方量取除栀子外所有药物，并按供试品溶液制备方法操作，得阴性对照溶液，进样 5 μl。

2.5 专属性检查 以丸剂供试品和阴性对照溶液的HPLC图谱对比可以看到(见图1)，阴性对照图谱中栀子苷峰对应位置处无干扰。

2.6 线性相关考察 精密量取栀子苷对照品溶液1、3、5、7、9 ml分别置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。分别精密吸取对照品溶液5 l，依次注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，记录栀子苷峰面积，以栀子苷峰面积对栀子苷量进行线性回归，得线性回归方程:Y=1636850x-8178.6，r=0.9998，表明栀子苷在0.0831～0.7479 g/ml时，质量浓度与峰面积积分值呈良好的线性关系。

图1 龙胆泻肝丸中栀子苷的HPLC图谱

2.7 精密度试验 取栀子苷对照品溶液，连续进样5次，每次 5 l。结果峰面积分别为 677891、677968、672102、672987、674067、676024，RSD 为 0.37%。

2.8 稳定性试验 分别在样品制备0 h、4 h、8 h、12 h、24 h后测定。测得峰面积的RSD为0.82%，(n=5)。可见供试品溶液中栀子苷在24 h内基本稳定。

2.9 重复性试验 取供试品溶液，按含量测定方法重复测定6 次。峰面积分别为:372065、372463、374512、376328、373407、376694，RSD 为 0.52%。

2.10 加样回收试验 采用加样回收试验。取本品，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入栀子苷对照品溶液20 ml，再精密加入甲醇5 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率50KHz)45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，用甲醇稀释至10 ml。进样10 l测定含量。共操作6次。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.11 样品测定 取3批龙胆泻肝丸按“供试品溶液的制备”项制备供试品溶液，依法测定。结果 0.3424%、0.3395%、0.3411%，RSD为0.43%。

3 讨论

3.1 测定波长选择。栀子苷为环烯醚萜苷，其紫外最大吸收波长为238nm，因此选择238nm作为测定波长。

3.2 流动相选择。药典记载栀子中栀子苷的含量测定中使用了乙腈-水(15∶85)系统，实际操作中对该系统考察发现，其基线不易走平，峰形和基线稳定性较差。用甲醇-水(23∶77)试验，发现其平衡时间较短，基线平稳，保留时间适中，流动相价格总体上亦较乙腈系统低，且在适当的保留时间内，随着流动相中有机相的比例减小，龙胆苦苷和栀子苷的分离度有所减小［5］。栀子苷和龙胆苦苷均为其主要的药理活性成分之一，且二者均为环烯醚萜苷，因此，参照药典方法最终确定使用正文中的流动相。

3.3 栀子为龙胆泻肝汤方中的臣药，测定其中的栀子苷含量具有较重要的代表意义。且复方中药多个指标的测定不但可以减少分析误差，更重要的是它可以直接反映药品的质量。该法简便、快速、准确，适用于龙胆泻肝制剂的质量控制，为院内制剂质量控制提供适合可靠的检验标准。

［1］ 段富津.方剂学.上海:上海科学技术出版社，1995:82-84.

［2］ 孙文学.龙胆泻肝汤在临床上的应用.第十五届中韩中医药学术研讨会论文集，2011.

［3］ 谢鸣.方剂学.北京:人民卫生出版社，2002:124-126.

［4］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版一部.北京:化学工业出版社，2005:药典173.

［5］ 刘瑞新.HPLC同时测定龙胆泻肝丸中龙胆苦苷和栀子苷的含量.中成药，2007，29(8):1170-1173.