湖北省鸡群内源性禽白血病病毒分子特征研究

温凌子，杨玉莹，梁雄燕，顾玉芳，多 婷，易艳芳 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

湖北省鸡群内源性禽白血病病毒分子特征研究

温凌子，杨玉莹，梁雄燕，顾玉芳，多 婷，易艳芳 (长江大学动物科学学院，湖北 荆州 434025)

为了解内源性禽白血病病毒在我国鸡群中的存在状况，利用特异性引物对湖北省鸡群—江汉鸡和灵山麻鸡的鸡胚中内源性禽白血病病毒进行了PCR检测。结果显示，所有的鸡胚中均检测出内源性禽白血病病毒EAV、ev、ev/J和ART-CH基因序列。进化树分析发现，相对于内源性病毒原型株E51，江汉鸡的EAV基因组更加接近于原型株EAV-0；江汉鸡和灵山麻鸡的ART-CH核苷酸序列之间相似度很高，但与已知的ART-CH5和ART-CH14核苷酸序列存在较大差异；尽管江汉鸡和灵山麻鸡的ev和ev/J核苷酸与其他已知的ev和ev/J的相关序列差异较小，但其在系统进化树上仍属于不同的分支。该结果说明江汉鸡和灵山麻鸡的内源性病毒基因的进化路径与其他已知的内源性病毒基因的进化路径不同。

内源性禽白血病病毒，ev基因座，ev/J，ART-CH

内源性禽白血病病毒(EndogenousAvianLeucosis/SarcomaVirus,EALSV)是一种存在于鸡基因组中，随宿主基因组遗传复制的前病毒DNA序列，主要包括CR1(chickenrepeat1,CR1)、ev基因座、内源性禽反转录病毒(endogenousavianretrovirus，EAV)和鸡基因组禽反转座子ART-CH[1-2]。由于EALSV涉及到外源性反转录病毒的进化、反转录病毒的致病机制等，特别是ev/J是具有外源性病毒对应体的少有的几个内源性病毒之一，在反转录病毒中很有代表性，近些年来受到广泛的关注。据报道，ev基因座与E亚群禽白血病病毒相关，每种鸡的基因组中平均约有5个ev基因座[1,3]。EAV序列高度保守，仅存在于所有的原鸡属物种中，EAV家族成员不表达传染性病毒粒子，但其具有RT活性，并且已经在活疫苗中被证实[3-4]；ART-CH属于反转座子，是一种相对较小的内源性反转录病毒序列，其gag区与禽白血病病毒的相应区域同源性约为35%[5]。ev/J与其他所有的内源性禽白血病病毒序列明显不同，其env区域与J亚群禽白血病病毒(AVL-J)的env基因同源性超过95%，因此被认为是AVL-Jenv基因的起源[6-8]。

内源性禽白血病病毒在我国鸡群中的存在状况尚不清楚，本研究采用特异性引物对湖北省重要鸡群江汉鸡和灵山麻鸡进行内源性反转录病毒PCR检测，旨在分析湖北省重要鸡群内源性禽白血病病毒的相关生物学特性，为进一步探索内源性禽白血病病毒与外源性病毒的进化、致病机理、免疫耐受等提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

江汉鸡受精卵10枚，购自武汉三益家禽育种有限公司；灵山麻鸡受精卵10枚，购自湖北省荆州市天羽禽业有限公司。

1.2 主要试剂

Taq酶，dNTP等PCR试剂、pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR引物、PCR产物回收试剂盒为上海捷瑞生物公司产品；质粒提取试剂盒为北京鼎国生物公司产品。

1.3 方法

(1)DNA模板制备 将2个品系鸡待用受精卵孵育至11日龄。取鸡胚组织，用改良的酚氯仿法[9]提取DNA，溶于灭菌双蒸水中，-20℃保存。

(2)内源性禽白血病病毒基因扩增 内源性禽白血病病毒的特异性引物见表1。EAV基因的特异性引物(F1/R1)分别位于env基因的跨膜蛋白(TM)编码区和长末端重复序列区(LTR)；ART-CH特异性引物(F2/R2)根据其gag基因设计；ev基因座和ev/J特异性引物(F3/R3-F8/R8)根据其各自env基因设计。

表1 内源性禽白血病病毒特异性引物

PCR采用25μl反应体系，包括1μl模板DAN、2.5μl的10×buffer、2.5μl的MgCl2(25mmol/L)、1.5μl的2.5mmol/L dNTPs、1μl的正向引物(25pmol)、1μl的反向引物(25pmol)、0.5μl的Taq聚合酶(5U/μl)、16μl ddH2O。循环条件为：94℃预变性2min，主循环94℃1min，退火1min(各引物退火温度详见表1)，72℃1min，共30个循环，终末延伸72℃7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色分析[7]。

(3)目标片段的克隆转化 按照试剂盒说明，分别对特异性扩增产物进行回收，得到的纯化回收产物，溶解于ddH2O，-20℃保存。连接反应体系组成为纯化目的DNA片段2.5μl、pMD19-T Simple Vector 0.2μl、SolutionⅠ2.5μl，16℃连接过夜。采用CaCl2法制备DH5α感受态细胞，进行连接产物转化细菌[7]。使用试剂盒，进行小量质粒的提取，特异性PCR鉴定阳性克隆。

(4)DNA片段的测序及序列分析 阳性克隆菌送北京诺赛基因公司测序，结果用核酸分析软件Lasergene分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

内源性禽白血病病毒特异性PCR显示，江汉鸡与灵山麻鸡均扩增出EAV、ev、ev/J和ART-CH4种内源性病毒序列，但是二者又存在差异，ev基因座特异性引物F3/R3未能从灵山麻鸡基因组扩增出相应的DNA片段。

根据使用内源性禽白血病病毒特异性引物的不同，从2个品系鸡中扩增得到的DNA片段，分别命名为江汉鸡：JF1～JF8;灵山麻鸡：LF1～LF8。

2.2 目标片段的克隆与测序结果

PCR产物与pMD19-T Simple Vector连接转化后，挑取阳性克隆，提取质粒，以相应的内源性禽白血病病毒特异性引物分别对转化菌进行PCR鉴定，均扩增出了预计大小条带(图1，图2)，表明目的片段克隆成功。测序结果显示，JF1～JF6、JF8大小分别为241bp、659bp、1958bp、881bp、713bp、266bp、785bp；LF1、LF2、LF4～LF6、LF8大小分别为241bp、659bp、881bp、713bp、266bp、785bp。

M:DNAMarker;1:JF1;2:JF2;3:JF3;4:JF4;5:JF5;6:JF6;7:JF7;8:JF8

M:DNAMarker;1:JF1;2:JF2;3:JF4;4:JF5;5:JF6;6:JF7;7:JF8

2.3序列分析结果

图3 EAV生物进化树

图4 ART-CH核苷酸序列生物进化树

图5 ev基因座核苷酸序列生物进化树分析

图6 ev/J env基因核苷酸序列生物进化树

测序结果Lasergene分析显示，江汉鸡、灵山麻鸡鸡胚中EVA的TM和LTR之间区域的核酸序列相互之间的同源性为71.7%，与EAV-0内源性序列的同源性分别为97.9%、70.9%；与E51内源性序列的同源性分别为71.3%、94.2%。这表明江汉鸡EAV与EAV-0同源性较高，而灵山麻鸡EAV与E51同源性较高。核酸序列进化树见图3。

核酸对比分析显示，江汉鸡、灵山麻鸡中ART-CH的gag核酸序列部分之间的同源性为93.8%，与基因库中已知的ART-CH5核酸序列同源性为91.2%，而与ART-CH14核酸序列的同源性仅为56.2%，2个品系鸡胚细胞中ART-CH的gag核酸序列部分相比ART-CH14有大量的缺失，进化树分析见图4。

江汉鸡、灵山麻鸡ev基因座中env基因之间的同源性为99.8%～100%，二者与ev基因座的原型株有Clone1，Clone3，Clone6同源性为98.2%～99.0%，其中与原型株ev-1的同源性高达99.2%，而与原型株ev-6的同源性较低，为98.2%。ev基因座的env基因核酸序列进化树分析见图5。

江汉鸡、灵山麻鸡中ev/J的env基因部分片段的核酸序列之间具有高度的同源性，为98.1%，与其他已知ev/J序列EAV-HP、SD9901、YZ9901的同源性为94.7%～100%。2个品系鸡胚细胞中ev/J的env基因核酸与外源性ALV-J标准株HPRS-103env基因核酸有高度同源性，为97.6%～98.1%。在2个品系鸡胚细胞中检测到的ev/J基因与其他已知的ev/J构建的进化树见图6。

3 讨论

内源性禽白血病病毒是存在于鸡基因组中，随宿主基因组遗传复制的前病毒DNA序列，主要包括CR1、ev基因座、EAV和ART-CH4类[1-2]。研究认为内源性病毒序列在外源性禽白血病病毒变异进化中具有潜在的重要作用，尤其是ev/J，其与ALV-J的env基因同源性高达90%以上，因此通常认为病毒新亚群ALV-J是由ev/J与ALV其他亚群发生基因重组而产生[6-8]。

本研究利用特异性引物对湖北省重要鸡群江汉鸡和灵山麻鸡鸡胚中的内源性禽白血病病毒序列进行了检测，结果证实2个品系的鸡基因组中均存在4个类型的内源性禽白血病病毒，并且不尽相同。

EAV核酸序列分析显示，江汉鸡和灵山麻鸡EAV与EAV-0、E51等已知EAV的相应区域核酸同源性在70.9%～97.9%之间，但是江汉鸡EAV与EAV-0同源性较高，而灵山麻鸡EAV与E51同源性较高，同源性分别为97.9%、94.2%。这与EVA感染原鸡属物种形成前的生殖细胞而存在于所有的原鸡属物种是一致的。但是，EAV群中不同的成员可能是在不同时期感染进入原鸡属的，例如，E51和E33可能比EAV-0更加原始[1,6]。因此，对于从湖北省重要鸡群，EAV感染进入灵山麻鸡可能进入感染进入江汉鸡要早，灵山麻鸡EAV与E51在进化树上位于同一分支。

ATR-CH序列分析显示，江汉鸡和灵山麻鸡ATR-CH序列之间联系紧密，同源性98.2%以上，但是二者与ATR-CH5(同源性91.0%)和ATR-CH14(56.2%)有较大的差别，特别是相比较ATR-CH14存在大的缺失。进化树树分析可知，江汉鸡与灵山麻基因组ATR-CHs与ATR-CH5、ATR-CH14处于不同的分支。

江汉鸡、灵山麻鸡的ev基因座和其他已知的e基因座中的env基因部分片段的核苷酸序列对比较，表明它们之间有较高的一致性。2个品系鸡的ev基因座与ev-1原型株相关性最高，特别是灵山麻鸡。进化树分析显示，灵山麻鸡的ev基因座与ev-6原型位于同一分支上，且与ev-3、ev-6的相关性高于江汉鸡，表明了灵山麻鸡中的ev基因座的进化路径与ev原型较江汉鸡中的ev基因组更为接近。

核酸序列分析显示，江汉鸡、灵山麻鸡中的ev/J中的env基因核苷酸序列之间以及与其他已知内源性ev/J基因的核苷酸序列有很高的同源性。被检测的2个品系鸡中ev/J的env基因部分与已知的ev/J序列EAV-HP的同源性为100%。进化树分析，江汉鸡、灵山麻鸡中的ev/J基因和其他已知内源性ev/J基因的核苷酸序列及外源性ALV-J标准株HPRS-103env基因核苷酸序列之间无明显的分支，这与外源性ALV-J可能是通过ev/J与其他外源性病毒重组进化而来的观点相一致。

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2013-01-18

温凌子(1988-)，女，硕士生，研究方向为动物病原微生物学。

杨玉莹，E-mail:yangyycn@gmail.com。

S852.65+7

A

1673-1409(2013)05-0049-04