骨友灵巴布膏微生物限度检查方法的建立

王瑛 杨铮 杨利红

骨友灵巴布膏微生物限度检查方法的建立

王瑛 杨铮 杨利红

目的建立骨友灵巴布膏的微生物限度检查方法。方法细菌计数采用培养基稀释法、霉菌及酵母菌计数采用平皿法，控制菌检查采用常规法与培养基稀释法。结果细菌、霉菌及酵母菌的菌回收率均大于70%，控制菌检查中，各阳性试验菌均检出，阴性对照无菌生长。结论本法可消除骨友灵巴布膏的抑菌作用，适用于该制剂的微生物限度检查。

骨友灵巴布膏;微生物限度检查;方法学验证

骨友灵巴布膏具有活血化瘀、消肿止痛的功效，用于骨质增生引起的功能性障碍、软组织损伤及大骨节病所引起的肿胀疼痛。为了有效控制药品的质量，保证微生物限度检查方法的科学性和检验结果的准确性，根据《中国药典》2010年版[1]附录微生物限度检查的新要求，对骨友灵巴布膏进行了微生物限度检查的方法学验证。

1 材料

1.1试药与培养基 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、溴化十六烷三甲基三甲铵琼脂培养基。以上均为北京三药生产。

1.2试验用菌 白色念珠菌[CMCC(F)98 001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98 003]，铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]、大肠埃希氏菌[CMCC(B)44 102]

1.3样品 骨友灵巴布膏(哈药集团人民同泰制药厂，批号：091101，规格：7 cm×10 cm/片)

2 方法与结果

2.1菌液制备 接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至改良马丁培液体养基中，在23℃～28℃培养24 h，取上述培养液用0.9%无菌氯化钠溶液10倍依次稀释至浓度约为50～100 cfu/ml备用；取黑曲霉菌新鲜斜面培养物，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液[2]适量将孢子洗下，并用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至浓度约为50～100 cfu/ml，备用。

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜斜面培养物于胰酪胨大豆肉汤培养基中，在30℃～35℃培养18～24 h；分别取上述培养液用0.9%无菌氯化钠溶液10倍依次稀释至浓度约为50～100 cfu/ml-1备用。

2.2供试液制备 取样品100 cm2，去掉橡胶膏剂的保护层，放置在无菌玻璃板上，粘贴面朝上，用无菌纱布覆盖橡胶膏剂的粘贴面上。然后将其置于含10 ml无菌聚山梨酯-80和90 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的三角瓶中，用力振荡30 min，制成1 ∶10供试液。

2.3细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 ①试验组:取1 ∶10供试液1 ml，分别加入5个平皿中(每皿0.2 ml)，加入各细菌试验菌1 ml,再加入营养琼脂培养基,按规定条件培养；霉菌及酵母菌计数采用平皿法：取 1 ∶10供试液1 ml，加入各霉菌及酵母菌试验菌1 ml,再加入玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件培养。(n=3)。②菌液组取稀释好各菌液1 ml，方法同试验组,测定所加试验菌数(n=3)。③供试品对照组测定样品本底的菌数，方法同试验组，不加阳性对照菌(n=3)。④稀释剂对照组取试验用稀释剂代替供试液测定，方法同试验组(n=3)。⑤回收率结果试验组菌回收率%=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。稀释剂对照组菌回收率%=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%。平均回收率结果见表1。

表1 细菌、霉菌及酵母菌方法验证的平均回收率(%)

从表1可以看出，5株试验菌的试验组菌回收率与稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，因此，可采用该方法测定样品 骨友灵巴布膏细菌、霉菌及酵母菌数。

2.4控制菌检查方法的验证

2.4.1试验组 取1 ∶10供试液10 ml(2份)，分别接种至100 ml胆盐乳糖培养基和200 ml营养肉汤培养基中，再分别加阳性对照菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌液各1 ml，摇匀，置30℃～35℃培养18～24 h。

2.4.2阴性对照组 取等量稀释剂，方法同试验组(不加阳性对照菌液)。

2.4.3验证结果试验组 检出阳性试验菌，阴性对照组无菌生长，见表2。

表2 控制菌检查方法学验证结果

从表2看出，该控制菌检查方法适用于本品的检查。

3 讨论

骨友灵巴布膏为外用贴膏剂，属于中药品种，《中国药典》2010年版以前未收载此剂型。因此，在实际操作中各单位采用的样品前处理方式不同，易造成样品溶解程度不一致，因而可能导致验证试验结果不可靠。笔者在进行本试验的过程中，供试品溶液的制备采用将样品贴于无菌纱布等材料上，以含表面活性剂的无菌溶剂进行浸泡，该法使样品的有效成分能够完全充分溶散，令验证方法更加准确。

骨友灵巴布膏具有抑菌作用，因此，细菌计数不能采用常规平皿法进行试验，本试验采用培养基稀释法进行测定，能够有效去除样品自身的抑菌作用。

[1] 中国药典.一部. 2010:79-88.

[2] 李云龙.中国药品检验标准操作规范.北京: 中国医药科技出版社, 2010:363.

150001 哈尔滨，黑龙江省食品药品检验检测所

王瑛