叶酸偶联O- 羧甲基壳聚糖的制备及其表征

武润平，李巧玲，刘晓霞，万郁楠，续丽丽，李洪刚

（中北大学理学院化学系，山西 太原 030051）

壳聚糖是一种常用的靶向药物载体生物材料，它具有无毒﹑无害的性质，且具有良好的生物相容性和降解性[1～3]，但是壳聚糖只溶于酸或弱酸性溶液中，这大大限制了它的应用范围。将壳聚糖进行羧甲基化，可以大大改良壳聚糖的性质。与传统的壳聚糖相比，羧甲基壳聚糖生物相容性更好，更易降解，性质更稳定，而且对负载药物无pH 值要求[4]。

传统的肿瘤治疗方法不仅会杀死肿瘤细胞，也会对正常细胞有毒性作用。叶酸化学性质简单，方便易得，无免疫原性，且叶酸对叶酸受体具有高度的亲和性[5～6]，所以叶酸常作为叶酸的受体在肿瘤治疗中起到了显著的作用。大多数实验均是将叶酸直接偶联到药物载体，对叶酸偶联水溶性壳聚糖载体报道较少。所以本文将壳聚糖的羟基进行羧甲基化，再将叶酸偶联至水溶性的O-羧甲基壳聚糖的活性基团氨基，得到叶酸偶联O-羧甲基壳聚糖(FCC)，能够较好地溶于中性和碱性溶液，且水溶性壳聚糖上较好地偶联叶酸分子，以期能够在靶向药物治疗中得到很好的应用。

1 试剂与仪器

壳聚糖(chitosan，分析纯)，一氯乙酸(chloroacetic acid，分析纯)，异丙醇(isopropanol，分析纯)，叶酸(folic acid，分析纯)，二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，化学纯)，N,N-二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide，分析纯)，其他药品和试剂均为分析纯。

FT-IR-Nicolet5700 型红外光谱仪， 751GD 型紫外 - 可见分光光度计，透析袋等。

2 实验方法

2.1 O-羧甲基壳聚糖的制备

准确称取3g 壳聚糖粉末，将其悬浮于40%的NaOH 溶液中，向其中缓慢滴加40mL 异丙醇后，冷冻过夜；向混合物中缓慢滴加氯乙酸和异丙醇的混合溶液在50℃下搅拌（分5 次滴加，每次间隔1h）。反应5h 后将混合物静置分层，弃上清液并加少量蒸馏水，然后用盐酸调节溶液的pH 至7，抽滤后用无水乙醇洗涤，最后冷冻干燥得O-羧甲基壳聚糖（OCMCs）。

2.2 叶酸偶联O-羧甲基壳聚糖的制备

称取叶酸（FA）0.3g，N,N-二环己基碳二亚胺（DCC），将其溶解于15mL 二甲基亚砜（DMSO）中，室温避光搅拌至叶酸全部溶解；然后向混合物中加入0.15g O-羧甲基壳聚糖（O-CMCS）和30mL 醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH=5.0），避光室温搅拌反应过夜，调pH 至9.0；分别用磷酸缓冲溶液和蒸馏水各透析3d，冷冻干燥得黄色粉末状固体（FCC）。

3 结果与讨论

3.1 FCC 的红外光谱表征

由图1 中(a)线可以看出，3416cm-1处的强吸收峰是-OH 和-NH2的特征吸收峰部分重叠的结果；1162cm-1﹑1077cm-1﹑1653cm-1的 吸 收 峰 分 别 是C-O-C﹑C-O 和乙酰基中C=O 的伸缩振动吸收峰；891cm-1处是伯胺-NH2的吸收带；891cm-1处是伯胺-NH2面内弯曲振动强吸收峰；1314cm-1较弱的吸收峰是C-N 缩振动,说明壳聚糖的氨基未被破坏，成功制得O-羧甲基壳聚糖。

图1(b)线是O-羧甲基壳聚糖接枝叶酸样品的红外光谱图。由图可知，1670cm-1对应于反应生成的酰胺键的吸收峰，对应于O-羧甲基壳聚糖的1722cm-1处有所增强；1580cm-1处由于引入了叶酸分子的苯环而得到增强；2970cm-1附近的吸收峰对应于-CH3中C-H 伸缩振动峰，1098cm-1处的吸收峰是醚键，此处的峰相对于羧甲基壳聚糖的振动吸收有所增强。这些都表明叶酸与羧甲基壳聚糖发生了偶联。

图1 叶酸偶联O-羧甲基壳聚糖的IR 图Fig.1 The IR of Folate O-carboxymethyl chitosan(FCC)

3.2 O-羧甲基壳聚糖中羧甲基取代度的测定

精密称取0.5g 所得O-羧甲基壳聚糖（O-CMCS）溶于50mL 0.1mol·L-1的标准盐酸溶液中，置于磁力搅拌器上完全溶解；用0.1mol·L-1的NaOH 溶液滴定上述溶液，用pH 计记录读数变化；利用二次微商法做图。

图2 O-羧甲基壳聚糖的取代曲线Fig.2 The replace curve of O-carboxymethyl chitosan(O-CMCS)

如图2 所示，pH 为2.1 处为滴定过量盐酸的小突越点，消耗NaOH 溶液体积为29.40mL，在pH 为4.3 处出现第一个突越峰，为-OH 位羧甲基的滴定终点，消耗NaOH 溶液的体积为V2=37.90mL。将其带入公式DS=0.203A/（1-0.058A），A=( V1-V2)×C/W，得DS=38.28%。

3.3 O-羧甲基壳聚糖的溶解性

称取0.5g 所得 O-羧甲基壳聚糖和壳聚糖，将其分别溶于pH 为3.0﹑3.5﹑4.0﹑4.5﹑5.0﹑5.5﹑6.0﹑6.5﹑7.0﹑7.5﹑8.0﹑8.5﹑9.0 的水溶液中，离心分离；取上清液用紫外分光光度计在200nm 处对其进行检测；将剩余的固体干燥称重，可得图3。

图3 壳聚糖和O-羧甲基壳聚糖的溶解性Fig.3 The Solubility of chitosan and O-carboxymethyl chitosan

由图3 可知，壳聚糖在弱酸性溶液中有较好的溶解性，随着pH 值的升高溶解性下降，当壳聚糖溶液的pH 值增至7 以上时，溶解度极小；而O-羧甲基壳聚糖在pH 值为3 以下时有较好的溶解性，在pH为4～6 时溶解性较差，在pH 值大于7 的溶液中同样有较好的溶解性，说明所制得的O-羧甲基壳聚糖在弱酸﹑弱碱以及中性溶液中均可溶。

3.4 叶酸偶联O-羧甲基壳聚糖中叶酸的修饰量

精密称取叶酸10.0mg 溶于50mL 水中，将其稀释定容至100mL，分别取1.0﹑1.5﹑2.0﹑3.0﹑4.0mL的叶酸溶液，再用去离子水稀释至10mL。以去离子水为空白对照，用紫外分光光度计在波长281nm处测定吸光度，以叶酸浓度对吸光度做标准曲线。取25mg O-羧甲基壳聚糖接枝叶酸（FCC）溶于去离子水中，定容至100mL，用紫外分光光度计检测FA 的含量，检测波长为281nm，按照标准曲线计算每mg O-羧甲基壳聚糖接枝叶酸（FCC）中叶酸的含量，得线性回归方程：y=44.2845x+0.1655，r2=0.9983。由线性回归方程计算得到叶酸的修饰量为17.8μg·mg-1，相当于O-羧甲基壳聚糖中每个羧甲基壳聚糖上大约偶联2 个叶酸分子。由于平均1个蛋白分子上偶联3 个叶酸分子就有很强的靶向性，所以我们认为已成功地在壳聚糖表面修饰了足量的叶酸。

4 结论

一系列的表征手段显示，本研究成功地制备了O-羧甲基壳聚糖，它能够较好地溶于中性和碱性溶液，并在壳聚糖表面修饰了足量的叶酸，以期使叶酸偶联O-羧甲基壳聚糖作为靶向载体能够更好地应用于抗肿瘤细胞的研究当中。

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