微波辅助水提梓树根皮中抑菌成分的研究

邵金华，黄国文，刘 恭

湖南科技学院生化系，湖南永州 425100

梓树皮为紫葳科梓属乔木植物梓树(Catalpa ovata G.Don)的皮，又名梓白皮、梓皮、梓木白皮、梓根白皮、土杜促，可入药，据《本草纲目》记载，具有清热、解毒、杀三虫和利尿的功能［1，2］。梓属植物中主要的化学成分有环烯醚萜类成分［3-5］、萘醌类成分［6，7］、苯酚类化合物［8］及一种新的苯乙烯双糖苷类［9］化合物。目前，国内外对梓树在医药临床方面的研究报告很多［10］，而对其在抗菌作用及抗菌成分方面的报道却很少。梓树的研究主要集中在梓树幼苗的培育，梓树果实，梓树花药及梓树叶有效成分的研究上［11］，而对其根皮在抗菌作用及抗菌成分方面报道较少。本实验以梓树根皮为实验材料对其抗菌活性进行了系统研究，并对其结果进行整理。旨在为植物抗菌化合物的开发利用提供一个新的资源，同时也为梓属植物资源的开发利用提供一个新思路，对于日益严峻的药品安全问题多劈一条路。

1 材料、试剂及仪器

1.1 材料

梓树根皮(采自湖南省永州市祁阳县)

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(来自学校微生物实验室)

1.2 试剂

牛肉膏(生化试剂)、蛋白胨(生化试剂)、氯化钠(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)、琼脂(生化试剂)、70%乙醇(分析纯)等。

1.3 仪器

XH-MC-1实验室微波合成仪(北京祥鹄科技发展有限公司)、01J2003-04型立式压力蒸汽灭菌器筒(上海博迅实业有限公司)、DZF-6051型真空干燥箱(上海贺德实验设备有限公司)、SW-CJ-2F洁净工作台(苏州安泰空汽技术有限公司)、HWS智能型恒温恒湿培养箱(宁波市科技园区新江南仪器有限公司)等。

2 实验方法

2.1 原料处理

将梓树皮用毛刷刷洗干净，用剪刀将其剪碎，然后放入烘箱中在65℃条件下将其烘干，用植物粉碎机将其粉碎，最后过40目筛(一定要把绒毛刷干净)。

2.2 供试菌株和菌悬液的制备

将枯草芽孢杆菌首先活化，然后转接入制备好的试管斜面上，于37℃恒温培养箱内培养24 h。用接种环挑取一环菌体放入装有10 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌悬液，备用。用1 mL无菌吸管吸取1 mL已充分混匀的枯草芽孢杆菌菌悬液，精确地放0.5 mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。另取一支1 mL吸管插入10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀，用此吸管吸取10-1菌液1 mL，精确地放0.5 mL至10-2试管中，此即为100倍稀释。其余依次类推。在每个倒入培养基的平板中分别加入200 uL已制备好的10-5枯草芽孢杆菌菌悬液，用涂布棒将其均匀涂抹在培养基的平板上，放置一段时间后备用。

2.3 抑菌活性的测定方法

用打孔机将滤纸圆片打成4 mm的圆片，在烘箱中经高压灭菌后，将其放在提取溶液中和空白对照的水中浸泡30 min，沥去多余的试液，将滤纸片用无菌镊子夹取，放入涂好菌液的培养基平板上。每皿成“+”形对称放置4张圆片，平行做三组，剩余一组为对照组。置于37℃恒温培养箱内培养24 h。培养结束后，用游标卡尺测量培养基中抑菌圈的直径(除去滤纸片的直径)。

2.4 单因素试验

用电子天平精确称取梓树皮2 g，若干份，分别在不同微波功率、料液比、微波提取时间、微波提取温度条件下提取，收集滤液，过滤。用干热灭菌过的滤纸片蘸取提取液和空白液，沥干后将其放入涂有枯草芽孢杆菌的培养基平板上，在培养箱中37℃下培养48 h后，测定抑菌圈的大小，以抑菌圈的直径大小为指标来研究该因素对抑菌化合物提取的影响。

2.5 正交实验

根据单因素实验的结果，以等量的提取剂(水)为空白对照，以微波功率、料液比、微波提取时间、温度为因素进行L9(34)正交实验，根据正交实验结果确定最佳工艺。

3 结果与分析

3.1 单因素实验

3.1.1 微波功率对抑菌化合物的影响

在提取时间为9 min、料液比为1∶20、温度为50℃时，微波功率对抑菌化合物提取的影响如图1所示。从图1可以看出:微波功率在100～300 W之间，随着功率的增加，抑菌圈的直径明显增大，而微波在300～500 W之间，抑菌圈直径的大小随着功率的增大反而减小。可见并不是微波功率越高对抑菌化合物的提取越好，由此可得微波功率在300 W时，对梓树皮中抑菌化合物的提取最好.

图1 微波功率对抑菌化合物提取的影响Fig.1 The effect of microwave power on extraction of antibacterial compounds

3.1.2 料液比对抑菌化合物提取的影响

在提取时间为9 min、微波功率为300 W、温度为50℃时，料液比对抑菌化合物提取的影响如图2所示。从图2可以看出，料液比在1∶10～1∶15之间，随着料液比的增大，抑菌圈的直径增大，而在1∶15～1∶30之间，抑菌圈直径的大小随着料液比的增大反而明显减小。一般来说，料液比越大，即溶剂用量越大，抑菌化合物得率也随之增大，试验结果显示当溶剂用量达到一定值后，得率降低，此时提取物质已基本提取完全。且过大的料液比会造成溶剂和能源的浪费，因此从降低成本等综合考虑，单因素试验确定料液比为1∶15(g/mL)比较合理。

图2 料液比对抑菌化合物提取的影响Fig.2 The effect of extraction time on extraction of antibacterial compounds

3.1.3 提取时间对抑菌化合物提取的影响

在料液比为1∶15、微波功率为300 W、温度为50℃时，提取时间对抑菌化合物提取的影响如图3所示。从图3可以看出，随着微波时间的增加，抑菌化合物抑菌圈显著提高.微波时间为9 min时得率达到最大，随后抑菌化合物抑菌圈不断下降(图3)。因此.最佳微波处理时间为9 min.原因可能是由于被微波辐射极性分子在电磁场中快速转向，产生相互摩擦，引起胞内温度迅速升高，快速高温使内部压力超过细胞空间膨胀能力，导致细胞内细胞器被破坏，加快促进抑菌化合物的扩散和渗透.但微波的强热效应长时问作用后，导致抑菌化合物发生分解。

图3 提取时间对抑菌化合物提取的影响Fig.3 The effect of extraction time on extraction of antibacterial compounds

3.1.4 温度对抑菌化合物提取的影响

在料液比为1∶15、微波功率为300 W、提取时间为9 min时，温度对抑菌化合物提取的影响如图4所示。从图4可以看出，温度在30～40℃之间，随着温度的升高，抑菌圈的直径增大，继续升高温度，抑菌圈直径的大小随着提取温度的升高反而减小。因为，温度的升高，降低了提取液的黏度，增大了扩散系数，增大抑菌化合物溶解度，提高了提取率。温度为40℃时抑菌化合物抑菌圈达到最大，继续升高温度，提取率反而下降。

图4 浸提温度对抑菌化合物提取的影响Fig.4 The effect of temperature on extraction of antibacterial compounds

3.2 正交实验

在单因素试验基础上，对微波功率、微波萃取时间、提取温度和料液比4个因素进行了L9(34)正交试验，每个试验做3次重复。其因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 L9(34)正交试验Table 2 Orthogonal test L9(34)

7 400 6 1∶20 40 12.1 8 400 9 1∶10 50 13.4 9 400 12 1∶15 30 14.5 K1 13.17 11.97 13.73 12.87 K2 14.03 13.27 13.53 14.07 K3 13.33 15.30 13.27 13.60极差R 0.86 3.33 0.46 1.20主次顺序 B＞D＞A＞C优水平 A2 B3 C1 D2优组合 A2B3C1D2

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

由表2中的极差分析可知，影响梓树皮中抑菌化合物提取主次顺序为:B＞D＞A＞C，最优组合为:A2B3C1D2，即微波萃取时间＞提取温度＞微波功率＞料液比。此顺序同方差分析的结果一致(见表3)。从方差分析的结果可以看出，微波提取时间对抑菌化合物提取有及极显著的影响，提取温度对抑菌化合物的提取有显著影响，料液比和微波功率对抑菌化合物的提取影响不显著。由此得出，提取梓树皮中抑菌化合物的最佳工艺条件为:微波功率300 W，提取时间12 min，料液比1∶10，温度40℃。由于正交表中没有此组合，因此采用此提取条件进行验证试验。

3.3 最佳条件的验证试验

按照上述最佳工艺条件A2B3C1D2制备三份供试液，进行验证试验。结果测得梓树皮中抑菌化合物的平均抑菌直径为17.22 mm，由此证明该方法稳定可行。

4 结论

微波辅助提取梓树根皮中活性物质的正交试验中，4个影响因素的主次顺序为:微波萃取时间＞提取温度＞微波功率＞料液比。

通过正交试验得到最佳的提取工艺条件为:微波功率300 W，提取时间12 min，料液比1∶10，温度40℃;采用此条件试验，抑菌化合物的抑菌直径可达17.22 mm。

微波辅助提取法具有简单、省时、产率高的优点，为梓树根皮的深入开发利用提供了新的技术途径。

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