米诺环素通过调控PI3K/Akt通路抑制硝普钠诱导的PC12细胞凋亡*

吴秀勤， 杨炼红△， 钟健强， 叶晋豪， 刘淑琼

(1中山大学孙逸仙纪念医院神经科， 广东 广州 510120；2增城市人民医院神经科，广东 广州 511300)

米诺环素通过调控PI3K/Akt通路抑制硝普钠诱导的PC12细胞凋亡*

吴秀勤1， 杨炼红1△， 钟健强2， 叶晋豪1， 刘淑琼1

(1中山大学孙逸仙纪念医院神经科， 广东 广州 510120；2增城市人民医院神经科，广东 广州 511300)

目的探讨PI3K/Akt信号通路在米诺环素(minocycline,MC)抑制硝普钠(sodium nitoprusside,SNP)诱导的PC12细胞凋亡中的作用。方法将体外培养的PC12细胞分为4组：空白对照组、SNP组、MC+SNP组和PI3K抑制剂LY294002+ MC+SNP组。用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡；Western blotting检测不同时点(0.5、1、2、3 h)各处理组PI3K/Akt通路蛋白p-Akt和Akt的表达。结果SNP处理PC12细胞24 h能抑制细胞生长,加入10 μmol/L MC预处理30 min可明显提高细胞活力，降低细胞凋亡率(P<0.05),抑制SNP诱导的PC12细胞凋亡。MC组的p-Akt表达高于其它组,而加入LY294002后可阻断MC的上述效应。结论MC可通过调控PI3K/Akt通路抑制SNP诱导的PC12细胞凋亡。

PI3K/Akt信号通路； 米诺环素； 细胞凋亡； PC12细胞

米诺环素(minocycline,MC)是一种四环素类衍生物的抗生素，抗菌谱广，脂溶性高，可以顺利通过血脑屏障，在中枢神经系统可达到有效的临床治疗药物浓度水平。近年来越来越多的研究表明，MC在脑外伤、脑缺氧、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、帕金森氏病、亨廷顿病、癫痫等动物模型中均有明显通过抗凋亡而起神经保护作用[1-3]。

关于MC抗凋亡的机制研究，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号途径是近年来的研究热点。新近有研究发现MC通过保持PI3K/Akt信号途径的活性[4]，抑制谷氨酸的释放和谷氨酸受体，抑制谷氨酸诱导的细胞凋亡作用[5]。本实验通过建立PC12细胞凋亡模型，观察PI3K/Akt信号通路在MC抑制硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)诱导的PC12细胞凋亡中的作用。

材 料 和 方 法

1主要试剂和仪器

蛋白电泳装置、RPMI-1640培养基(Gibco)、马血清(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、Akt Ⅰ抗(兔抗鼠)(Cell Signaling Technology)、Ser473磷酸化的Akt Ⅰ抗(兔抗鼠)(Cell Signaling Technology)和GAPDH Ⅰ抗。HRP标记的Ⅱ抗(羊抗兔，羊抗鼠)、BCA蛋白定量试剂盒(上海博彩公司)、LY294002(Cell Signaling Technology)和ECL化学发光试剂盒(Millipore)。

2方法

2.1PC12细胞培养及诱导分化 PC12细胞(由中山大学医学院药理教研室惠赠)置于含10%马血清(Gibco)和5%胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640(Gibco)培养基中，37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养。

传代的PC12细胞中加入100 μg/L NGF，并培养在含胶原蛋白铺板的细胞内，经7～8 d的诱导分化，长出突触，用于实验。

2.2PC12细胞凋亡模型建立及MTT法测定细胞活力 PC12细胞按密度为1×108cells/L、100 μL/well接种于96孔板，放置37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养至细胞长到60%～70%时，分别加入终浓度为300、400、500、600、700、800 μmol/L SNP溶液作用24 h，每孔加入5 g/L MTT(Sigma)溶液20 μL，37 ℃、5%CO2细胞培养箱放置4 h后弃去培养基，加入二甲基亚砜(Sigma)150 μL，振荡10 min后，用酶标仪在570 nm波长处测定各孔的吸光度(A)。最后，按公式：细胞存活率(%)=处理组A值/对照组A值×100%，计算得出各组的细胞存活率。每个浓度设6个复孔，同时设与实验孔平行的空白对照(不含细胞外，其它条件相同的对照孔)，最后比色时对照孔调零。根据上述的结果，再利用SPSS计算出IC50，以此浓度建立PC12细胞凋亡模型。

将PC12细胞按密度为1×108cells/L、100 μL/well接种于96孔板，放置37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养至细胞长到60%～70%时，分别加入0、0.01、0.1、1、10 μmol/L MC预处理30 min,每孔加入500 μmol/L SNP溶液作用24 h后，按前述MTT法测定细胞活力。

2.3Annexin V-FITC /PI染色法检测细胞凋亡 将PC12细胞按密度为1×108cells/L、3 mL/well接种于6孔板中的1、2、3孔中，放置37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养至细胞长到50%～60%时，第3孔中加入3 μL 10 mmol/L MC，30 min后，于2、3孔中加入3 μL 500 mmol/L SNP后，将6孔板置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱培养24 h，再进行流式细胞术检测(按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书操作)。

2.4Western blotting检测Akt和p-Akt蛋白水平 细胞接种于60 mm培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，分别于0.5 h、1 h、2 h、3 h用预冷的PBS液洗3次，加入按100∶1∶1配合的细胞裂解液(RIPA)和蛋白酶抑制剂(PMSF)以及磷酸酶抑制剂，4 ℃静置30 min，用细胞刮刀刮下细胞，收集细胞悬液于1.5 mL Eppendorf管中，12 000 r/min离心30 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。取70 μg蛋白提取液，95 ℃煮沸5 min，样品于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)分离后，转移到PVDF膜上。用5%BSA封闭1 h，随后分别加入抗Akt、p-Akt和GAPDH抗体，4 ℃过夜，用TBST洗3次，每次10 min。ECL法显色。

3统计学处理

数据经SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1SNP诱导PC12细胞凋亡的最适合浓度

根据不同浓度(300、400、500、600、700、800 μmol/L)SNP作用24 h后PC12细胞的存活率，利用SPSS计算出SNP的IC50为500 μmol/L。

2MTT法测定MC对PC12细胞活性的影响

由图1可知，500 μmol/L SNP溶液处理PC12细胞24 h后，43.12%的细胞生长被抑制，与不加任何处理的细胞比较差异显著。而在用MC预处理30 min后，再用500 μmol/L SNP处理，则PC12细胞的存活率明显提高，并随着MC浓度的升高呈现明显剂量依赖性，说明MC能明显改善由SNP引起的细胞活性下降。

Figure 1. The effect of different concentrations of minocycline (MC) on the viability of PC12 cells induced by 500 μmol/L SNP.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSNP group.

图1不同浓度MC预处理对SNP诱导的PC12细胞活性的影响

3流式细胞术检测凋亡

如图2所示，实验分为空白对照组、SNP组、MC+SNP组和MC+SNP+LY294002组。结果显示，用SNP处理PC12细胞后，细胞的凋亡率较空白组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而MC预处理30 min后，再用500 μmol/L SPN处理，PC12细胞的凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 2. Effect of 10 μmol/L MC pretreatment for 30 min on the apoptosis rate of SNP-induced PC12 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSNP group;△△P<0.01vsSNP+MC group.

图2MC对PC12细胞凋亡的影响

4蛋白免疫印迹法检测Akt和p-Akt蛋白水平

SNP组与SNP+MC组比， Akt表达无明显差异，而SNP+MC组的p-Akt表达增高，差异有统计学意义。用PI3K/Akt通路阻滞剂LY294002后，MC所起的保护作用被抑制，表现为p-Akt的表达量明显减少，见图3。

讨 论

MC是第2代半合成的四环素类药物，其分子量小，具有较高亲脂性，容易透过血脑屏障到达中枢神经系统，动物模型研究表明,MC在脑中可以达50%的血药峰浓度[6]，具有较高的生物学活性。目前，MC对中枢神经系统的作用已成为研究的热点。越来越多的研究都致力于研究其对中枢神经系统的作用机制以望MC能更好地运用于临床治疗。本课题组在之前的实验已证实MC可抑制海马小胶质细胞活化、增生和炎症因子肿廇坏死因子α的释放[7]。而其它研究则表明MC可通过抗凋亡而起神经保护作用，但其机制目前尚无报道。

Figure 3. Effects of MC on the expression of Akt and p-Akt in PC12 cells.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSNP group;△△P<0.01vsSNP+MC group.

图3MC对PC12细胞Akt和p-Akt表达的影响

关于MC抗凋亡的机制研究，PI3K/Akt信号途径是近年来的研究热点。MC能通过保持PI3K/Akt通路的活性而减少大鼠缺血诱导的室性心律失常的发生[8]。Wilkins等[9]发现MC通过PI3K/Akt途径减少一氧化氮氧化介导的体外神经和轴突损伤。可见MC与PI3K/Akt通路有着密切的关系，由此我们猜想MC可能通过调节PI3K/Akt通路的活性而发挥其抗神经元凋亡、保护神经元的作用。因此，本实验选用PC12细胞，用NGF诱导产生突触后作为神经元模型，用SNP诱导PC12细胞凋亡，再用MC预处理，研究MC是否可通过调控PI3K/Akt信号通路的活性以抑制SNP诱导的PC12细胞凋亡。PC12细胞是大鼠肾上腺髓质瘤嗜铬细胞瘤细胞系，富含酪氨酸羟化酶、单胺氧化酶和儿茶酚胺氧位甲基转移酶，通过NGF诱导产生突触，具有神经分泌的性质，因此被广泛用于神经病学的研究[10]。

PI3K/Akt信号转导途径是细胞内重要的信号转导通路，在细胞的凋亡、增殖、存活等活动中具有重要的生物学功能。PI3K是磷脂激酶家族中的一个重要成员，是由p110催化亚单位和p85调节亚单位组成的异源二聚体。蛋白生长因子和它的受体结合，诱导受体胞浆部分酪氨酸残基自身磷酸化，募集并且激活PI3K。PI3K磷酸化磷脂酰肌醇4，4-二磷酸，使它转化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸，通过PH结构域使Akt定位于细胞膜内表面，接着通过磷酸化2个重要的残基Thr308(激酶结合域)和Ser473(疏水序基)使Akt激活。Akt是分子量约为60 kD的丝/苏氨酸激酶。Akt能介导多种生物学效应，是重要的抗凋亡调节因子，是PI3K信号转导途径中一个重要的下游靶激酶[11]。因此，我们的实验主要检测Akt及p-Akt的蛋白表达，以观察PI3K/Akt通路的活性。

本实验发现，MC预处理30 min，可明显改善细胞活性，并具有剂量依赖性。在给予10 μmol/L MC时，细胞存活率最大，为79.11%。同时，细胞凋亡从9.39%降到8.27%，说明MC具有显著保护PC12细胞的作用。Western blotting结果显示MC可使p-Akt表达增加，而加入PI3K/Akt通路阻滞剂LY294002后可阻滞该现象，说明MC可通过调控PI3K/Akt通路抑制神经元凋亡。

[1] Zhu S, Stavrovskaya IG, Drozda M, et al. Minocycline inhibits cytochromecrelease and delays progression of amyotrophic lateral sclerosis in mice[J]. Nature, 2002, 417(6884): 74-78.

[2] Wang X, Zhu S, Drozda M, et al. Minocycline inhibits caspase-independent and -dependent mitochondrial cell death pathways in models of Huntington’s disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(18):10483-10487.

[3] Popovic N, Schubart A, Goetz BD,et al. Inhibition of autoimmune encephalomyelitis by a tetracycline[J]. Ann Neurol, 2002, 51(2):215-223.

[4] Fox C, Dingman A, Derugin N, et al. Minocycline confers early but transient protection in the immature brain following focal cerebral ischemia-reperfusion[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2006, 26(3):446.

[5] Pi R, Li W, Lee NT, et al. Minocycline prevents glutamate-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by differential regulation of p38 and Akt pathways[J].J Neurochem, 2004, 91 (5):1219-1230.

[6] Yrjanheikki J, Keinanen R, Pellikka M, et al. Tetracyclines inhibit microglial activation and are neuroprotective in global brain ischemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95 (26): 15769-15774.

[7] 范燕明，杨炼红，刘淑琼.米诺环素对癫痫大鼠海马小胶质细胞的抑制作用[J].中华神经医学杂志,2011, 10 (9) :865-868.

[8] Hu X, Wu B, Wang X, et al. Minocycline attenuates ischemia-induced ventricular arrhythmias in rats[J]. Eur J Pharmacol, 2011, 654(3):274-279.

[9] Wilkins A, Nikodemova M, Compston A, et al. Minocycline attenuates nitric oxide-mediated neuronal and axonal destructioninvitro[J]. Neuron Glia Biol, 2004, 1(3)：297-305.

[10] 乐 亮，李晶洁，黎仕锋，等.米诺环素抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡和线粒体功能损伤[J].中国病理生理杂志,2011,27(5):895-899.

[11] Franke TF, Hornik CP, Segev L, et al. PI3K/Akt and apoptosis: size matters[J].Oncogene, 2003, 22(56):8983-8998.

[12] Nashida T, Takuma K, Fukuda S,et al.The specific Na+/Ca2+exchange inhibitor SEA0400 prevents nitric oxide-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells[J].Neurochem Int,2011,59(1):51-58.

[13] 杨炼红，蒋龙元，蔡晓冬，等.Bcl-xl基因对硝普钠诱导SY5Y细胞凋亡的抑制作用[J].中山大学学报：医学科学版,2012,33(4):449-453.

Minocyclinesuppressessodiumnitroprusside-inducedapoptosisinPC12cellsbyregulatingPI3K/Aktsignaling

WU Xiu-qin1, YANG Lian-hong1, ZHONG Jian-qiang2, YE Jin-hao1, LIU Shu-qiong1

(1DepartmentofNeurology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofNeurology,ZengchengPeople’sHospital,Guangzhou511300,China.E-mail:Docylh@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the role of PI3K/Akt signaling in the anti-apoptotic effect of minocyline (MC) on the apoptosis of PC12 cells induced by sodium nitroprusside (SNP).METHODSPC12 cells were divided into 4 groups: blank control group, SNP (500 μmol/L) group, MC (10 μmol/L)+SNP group and LY294002+MC+SNP group. The cell viability was observed by MTT assay. The expression of Akt and p-Akt was determined by Western blotting.RESULTSThe viability of the PC12 cells decreased after exposed to 500 μmol/L SNP for 24 h. Meanwhile, MC at concentration of 10 μmol/L significantly blocked the effect of SNP, such as decreasing the cell viability. Pretreatment with LY294002 for 60 min prior to exposure of the PC12 cells to MC and SNP down-regulated the expression of p-Akt induced by SNP.CONCLUSIONMinocycline regulates PI3K/Akt signaling pathway to restrain the apoptosis of PC12 cells induced by SNP.

PI3K/Akt signaling pathway; Minocycline; Apoptosis; PC12 cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.015

1000- 4718(2013)04- 0660- 04

2012- 12- 07

2013- 03- 18

广东省自然科学基金资助项目(No.S2011010004626)

△通讯作者 Tel: 020-81332621; E-mail: Docylh@yahoo.com.cn