甜菜碱对戊四氮致痫大鼠海马GFAP、甘氨酸和甘氨酸受体表达的影响*

王 辉, 王淑湘, 崔国利, 卢春凤， 刘 蕾， 刘君星， 马小茹, 王芳芳， 梁衍锋， 吴佳梅， 毛金军， 王淑秋△

(1佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007; 2佳木斯大学第一附属医院检验科，黑龙江 佳木斯154002)

甜菜碱对戊四氮致痫大鼠海马GFAP、甘氨酸和甘氨酸受体表达的影响*

王 辉1, 王淑湘1, 崔国利2, 卢春凤1， 刘 蕾1， 刘君星1， 马小茹1, 王芳芳1， 梁衍锋1， 吴佳梅1， 毛金军1， 王淑秋1△

(1佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007;2佳木斯大学第一附属医院检验科，黑龙江 佳木斯154002)

目的研究甜菜碱对癫痫大鼠海马胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)、甘氨酸(Gly)及甘氨酸受体(GlyR)表达的影响。方法将健康雄性Wistar大鼠随机分为：正常对照组(腹腔注射生理盐水，1.0 mL生理盐水灌胃);癫痫组(腹腔注射戊四氮，1.0 mL生理盐水灌胃);甜菜碱高、中、低浓度组(腹腔注射戊四氮，甜菜碱灌胃);丙戊酸钠组(腹腔注射戊四氮，丙戊酸钠灌胃)。实验结束后大鼠眼眶取血检测血清中同型半胱氨酸的含量；在低温条件下迅速取脑组织，分析Gly含量的变化，免疫荧光检测GFAP的水平，兔疫荧光和Western bloting检测海马区GlyR表达的变化。结果各组大鼠大发作潜伏期无显著差异(P>0.05)，但是甜菜碱治疗组较癫痫组的首次大发作持续时间显著缩短(P<0.01)。癫痫组同型半胱氨酸的含量与正常组比较显著降低(P<0.01)，甜菜碱高、低浓度组同型半胱氨酸含量与癫痫组比较明显降低(P<0.05)。癫痫组甘氨酸的含量与正常对照组相比显著下降(P<0.01)。甜菜碱高、中、低浓度组甘氨酸的含量与癫痫组比较显著增高(P<0.01)。免疫荧光检测GFAP结果，癫痫组与正常组比较显著增高(P<0.01)，而甜菜碱高中低浓度与癫痫组相比显著降低(P<0.01)。免疫荧光与Western bloting检测GlyR结果，癫痫组GluR的表达与正常对照组相比显著降低(P<0.01)，甜菜碱高、中、浓度组较癫痫组显著升高(P<0.01)。结论甜菜碱具有较好的抗癫痫作用。

甜菜碱； 癫痫; 同型半胱氨酸； 胶质细胞原纤维酸性蛋白； 甘氨酸； 甘氨酸受体

癫痫(epilepsy)是神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二顽症，具有长期性、反复发作性和难治性的特点，严重危害人类的健康。癫痫发生机制是由于人脑皮层神经细胞过度兴奋和(或)过度同步化引起的一系列短暂脑功能失常，是种慢性脑部疾病，具有反复发作、突然发生、突然终止、临床症状表现多样等特点。日前癫痫的治疗仍以药物为主，但是抗癫痫药发展非常缓慢[1]。甜菜碱(betaine)对人体的心血管类、神经类、肝脏类和高半胱氨酸尿症有一定的治疗作用[2]。本实验通过检测甜菜碱对戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)所致癫痫大鼠血清中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)含量以及对海马胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、甘氨酸(glycine,Gly)和甘氨酸受体(glycine receptor，GlyR)表达的影响，旨在阐明甜菜碱的抗癫痫作用。

材 料 和 方 法

1动物

健康雄性清洁级Wistar大鼠，初始体重(200±20) g,由大连医科大学提供。

2主要试剂

PTZ、甜菜碱、丙戊酸钠和磺基水杨酸购自Sigma；兔抗GlyR购于Santa Cruz；PVDF膜购于Millipore；FITC标记的羊抗兔lgG购于北京中衫；Tween 20购于Americo；多聚赖氨酸处理过的防脱片、辣根过氧化物酶标记羊抗兔lgG、BSA、抗体稀释液、PBS和枸橼酸盐购于武汉博士德生物工程有限公司；L-8900氨基酸分析仪购自HITACHI; EPS-300电泳仪购自上海天能科技有限公司。

3主要方法

3.1动物模型的建立 健康雄性清洁级Wistar大鼠48只，随机分为:正常对照组;癫痫组;甜菜碱高、中、低浓度组；丙戊酸钠组。癫痫组、甜菜碱组和丙戊酸钠组每天腹腔注射PTZ(35 mg/kg)，连续注射28 d后停止给药，1周后再次以上述剂量的PTZ点燃，选择点燃后连续出现5次Ⅱ级以上症状并存活的动物做后续实验；正常对照组每天腹腔注射相同体积的生理盐水。从腹腔注射PTZ当天开始，甜菜碱高、中、低浓度组用甜菜碱灌胃，剂量分别为450 mg·kg-1·d-1、225 mg·kg-1·d-1和112.5 mg·kg-1·d-1。丙戊酸钠组用丙戊酸钠灌胃，剂量为200 mg·kg-1·d-1。正常对照组和癫痫组用生理盐水灌胃，1.0 mL·d-1。大鼠癫痫发作采用Racine分级标准：0级，无发作反应；Ⅰ级，节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛；Ⅱ级，点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛；Ⅲ级，出现前肢阵挛但不伴随直立；Ⅵ级，前肢阵挛伴随直立；Ⅴ级，全身强直阵挛发作而跌倒。

3.2血清中Hcy的含量检测 大鼠眼眶取血，血液室温放置1 h，4 000 r/min离心10 min，取上清，-80 ℃冰箱保存。待送佳木斯大学附属医院送检。

3.3氨基酸分析仪检测甘氨酸的含量 大鼠麻醉后断头，迅速取出海马，精确称重。置样品于冰镇玻璃管中，加入10%磺基水扬酸(100 mg/ 4 mL)，冰浴下以玻璃匀浆器乎动匀浆并离心(4 ℃、15 000 r/min, 20 min)，取上清液，-40 ℃冰箱冻存。

3.4免疫荧光法检测海马区GFAP和GlyR表达 切片脱蜡及水化，微波炉抗原热修复，5%BSA封闭，分别滴加Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，荧光Ⅱ抗染色37 ℃，2 h。滴加PI 10 min。PBS洗片，封片。用Image-Pro Plus图像处理软件系统分析。

3.5Western bloting法检测海马区GlyR表达 4 ℃条件裂解30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清；测定样品蛋白含量；SDS聚丙烯酸胺凝胶电泳；4 ℃转膜2 h，TBST漂洗3次；室温封闭孵育1 h TBST,Ⅰ抗4 ℃孵育过夜,TBST漂洗3次,Ⅱ抗37 ℃平缓摇动孵育1 h,TBST漂洗3次,ECL发光显影,CIS凝胶图像处理系统分析。

4统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较用单因素方差分析，应用IBM SPSS Statistics 21.00统计软件处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1动物模型复制

甜菜碱各浓度组和癫痫组所有动物均点燃成功，并经测试均可发生连续5次Ⅱ级以上癫痫发作，主要发生在PTZ腹腔注射后4 min内，且发作程度不一。大发作的典型症状为首先出现耳部和嘴部的阵挛、点头、甩尾，进而发生前肢的阵挛抽搐并逐渐加重，最终导致四肢抽搐、不能站立、摔倒翻滚。正常对照组动物整个实验过程中未出现任何级别的痫样发作。

首次大发作的潜伏时间各组之间无差异，而持续时间各用药组均小于癫痫组(P<0.01)，见表1。

表1各组大鼠大发作潜伏期和首次大发作持续时间

Table 1. Latency and duration of the first grand mal seizure in various groups(Mean±SD)

GroupnLatency(min)Duration(s)PTZ530.43±0.71240.58±10.42PTZ+betian(450mg·kg-1·d-1)730.68±0.83180.94±9.75##PTZ+betian(225mg·kg-1·d-1)733.00±0.67160.11±4.11##PTZ+betian(112.5mg·kg-1·d-1)632.75±0.82180.39±4.03##PTZ+sodiumvalproate630.12±0.48133.00±3.15##

##P<0.01vsPTZ.

2大鼠血清中同型半胱氨酸的含量

癫痫组同型半胱氨酸的含量与正常组比较显著降低(P<0.01)；甜菜碱高、低浓度组同型半胱氨酸含量与癫痫组比较明显降低(P<0.05)。而甜菜碱中浓度与癫痫组相比虽然也有所降低但差异无统计学意义(P>0.05)；甜菜碱高、低浓度组与丙戊酸钠组相比差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2各组大鼠血清中同型半胱氨酸含量

Table 2. Level of homocysteine (Hcy) in serum of rats in various groups(μmol/L.Mean±SD)

GroupnHcyControl611.90±1.07PTZ59.30±1.24**PTZ+betian(450mg·kg-1·d-1)77.91±0.64#PTZ+betian(225mg·kg-1·d-1)78.67±1.13PTZ+betian(112.5mg·kg-1·d-1)67.47±0.89#PTZ+sodiumvalproate67.45±0.97#

**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsPTZ.

3大鼠海马中甘氨酸的含量

癫痫组Gly的含量与正常组比较显著降低(P<0.01)；甜菜碱高、中、低浓度组和丙戊酸纳组Gly含量与癫痫组比较明显增高(P<0.01);甜菜碱高、中、低浓度组Gly含量与丙戊酸钠组相比亦明显增高(P<0.01)，见表3。

表3各组大鼠海马中Gly含量

Table 3. Hippocampal Gly level of rats in various groups(μmol/L.Mean±SD)

GroupnGlyControl62.60±0.27PTZ51.67±0.10**PTZ+betian(450mg·kg-1·d-1)72.20±0.11##△△PTZ+betian(225mg·kg-1·d-1)72.27±0.08##△△PTZ+betian(112.5mg·kg-1·d-1)62.37±0.09##△△PTZ+sodiumvalproate62.00±0.13##

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsPTZ;△△P<0.01vsPTZ+sodium valproate.

4大鼠海马区GFAP免疫荧光结果

癫痫组大鼠海马区GFAP荧光强度与正常组比较显著增高(P<0.01)；甜菜碱高、中、低浓度组和丙戊酸钠组大鼠海马区GFAP荧光强度与癫痫组比较明显降低(P<0.01)；甜菜碱高、中、低浓度组与丙戊酸钠组相比显著增高(P<0.01)，见图1、表4。

Figure 1. Expression of GFAP in the of hippocampus of rats (×400).A：control；B：PTZ；C：PTZ+betian(450 mg·kg-1·d-1)；D:PTZ+betian(225 mg·kg-1·d-1)；E：PTZ+betian(112.5 mg·kg-1·d-1)；F：PTZ+sodium valproate.

图1各组大鼠海马区GFAP的表达

表4各组大鼠海马区GFAP荧光强度

Table 4. Fluorescence intensity of GFAP in the hippocampus of rats in various groups(Mean±SD)

GroupnFluorescenceintensityControl6197.00±0.21PTZ5250.07±0.65**PTZ+betian(450mg·kg-1·d-1)7220.00±0.03##△△PTZ+betian(225mg·kg-1·d-1)7229.05±14.69##△△PTZ+betian(112.5mg·kg-1·d-1)6230.86±0.01##△△PTZ+sodiumvalproate6217.67±3.72##

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsPTZ；△△P<0.01vsPTZ+sodium valproate.

5大鼠海马区GlyR免疫荧光结果

癫痫组大鼠海马区GlyR荧光强度与正常组比较显著降低(P<0.01)；甜菜碱高、中、低浓度组和丙戊酸钠组大鼠海马区GlyR荧光强度与癫痫组比较明显增高(P<0.01);甜菜碱高、中、低浓度组与丙戊酸钠组相比亦显著增高(P<0.01),见图2、表5。

Figure 2. Expression of GlyR in the hippocampus of rats (×200).A：control；B：PTZ；C：PTZ+betian(450 mg·kg-1·d-1)；D:PTZ+betian(225 mg·kg-1·d-1)；E：PTZ+betian(112.5 mg·kg-1·d-1)；F：PTZ+sodium valproate.

图2各组大鼠海马区甘氨酸受体的表达

表5各组大鼠海马区甘氨酸受体荧光强度

Table 5. Fluorescence intensity of GlyR in the hippocampus of rats in various groups(Mean±SD)

GroupnFluorescenceintensityControl6253.82±19.00PTZ5127.18±21.51**PTZ+betian(450mg·kg-1·d-1)7240.38±10.60##△△PTZ+betian(225mg·kg-1·d-1)7226.71±14.00##△△PTZ+betian(112.5mg·kg-1·d-1)6235.86±18.60##△△PTZ+sodiumvalproate6187.67±21.70##

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsPTZ；△△P<0.01vsPTZ+sodium valproate.

6Westernbloting结果

癫痫组大鼠海马区GlyR表达与正常组比较显著降低(P<0.01)；甜菜碱高、中、低浓度组大鼠海马区GlyR蛋白表达与癫痫组比较明显增高(P<0.01)，与丙戊酸钠组比较亦明显增高(P<0.01)，见图3、表6。

讨 论

癫痫是一组由大脑神经元反复、异常、过度同步化放电所引起的短暂中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病，脑内抑制性神经系统功能减弱，而神经元兴奋性增加及过度同步化发放是产生癫痫的基本条件。本实验结果显示甜菜碱治疗组可以显著减少大鼠癫痫大发作的持续时间，表明甜菜有抗癫痫作用。但是仍然不如经典抗癫痫药物丙戊酸钠效果显著。

Figure 3. Expression of GlyR in the hippocampus of rats in va-rious groups. A：control ；B：PTZ；C：PTZ+betian(450 mg·kg-1·d-1)；D:PTZ+betian(225 mg·kg-1·d-1)；E：PTZ+betian(112.5 mg·kg-1·d-1)；F：PTZ+sodium valproate.

图3各组大鼠海马区甘氨酸受体蛋白的表达

表6各组大鼠海马区甘氨酸受体蛋白表达

Table 6. Expression of GlyR in the hippocampus of rats in various groups(Mean±SD)

GroupnGlyRControl60.89±0.11PTZ50.63±0.04**PTZ+betian(450mg·kg-1·d-1)70.88±0.14##△△PTZ+betian(225mg·kg-1·d-1)70.86±0.12##△△PTZ+betian(112.5mg·kg-1·d-1)60.83±0.08##△△PTZ+sodiumvalproate60.73±0.02▲

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsPTZ；▲P<0.05vsPTZ;△△P<0.01vsPTZ+sodium valproate.

研究证实，Hcy为兴奋性氨基酸，过度积聚能导致神经细胞兴奋性增加和神经细胞损害，在癫痫病理形成中扮演关键角色。Hcy作为一种兴奋性物质，通过刺激N-甲基-D-天门冬氨酸受体对神经元发挥毒性作用，导致神经损伤，并认为高Hcy血症可能是癫痫发作的致病因素之一[3]。本实验癫痫模型是经典方法PTZ点燃，各组Hcy均在正常值内，癫痫组大鼠血清中Hcy的含量降低说明在最后一次复燃大鼠后，机体本身会有抗癫痫作用；维持了4周的甜菜碱灌胃后，高、低浓度甜菜碱可显著的降低了Hcy的含量，使其达到很好的抗癫痫效果。但中浓度甜菜碱对Hcy的降低作用不明显，可能是由于研究样品过小导致的。

星形胶质细胞对脑细胞外环境的控制中起关键作用，具有限制胞外钾离子和兴奋性氨基酸谷氨酸盐堆积的作用[4]。而GFAP是星形胶质细胞特有的一种中间丝蛋白，常被作为星形胶质细胞的特异性标志物，它代表了大多数的神经胶质细胞。它的激活常出现在神经元受损的部位，并被认为是神经元受损的结果。随着癫痫发生，神经元的损伤，星形胶质细胞显著增殖，神经胶质瘢痕形成[5]。本实验GFAP免疫荧光实验发现癫痫组荧光强度增加，而用药组均能缓解癫痫对神经元的破坏。

GlyR是一种经典的位于神经细胞突触后膜的配体门控氯离了通道型受体，与Gly结合后开放，促进Cl-流入，因此也被称为Gly门控氯离子通道。Cl-内流可使突触后膜超极化，因此中和了兴奋性神经递质引起的去极化，发挥抑制效应。GlyR介导的抑制性神经传递在哺乳动物中枢神经系统反射活动、随意运动调节和感觉信号的处理中具有重要作用[6]。Gly为抑制性氨基酸可提高神经元的保护性抑制，继而减少海马区神经细胞的凋亡[7]。因此Gly和GlyR减少会诱发癫痫。本实验检测出甜菜碱治疗组其Gly和GlyR均会增加。而丙戊酸钠在增加GlyR的方面并不是很强，说明甜菜碱的抗癫痫机制可能与GlyR信号有关而丙戊酸钠的作用与GlyR无关。

Halle等[8]的研究发现，长途运输前后给牛饲喂甜菜碱可明显降低运输中的应激并加快体重恢复速度。甜菜碱可以通过降低体内高半胱氨酸含量而减轻其对谷氨酸脱羧酶活性的抑制，有利于脑内γ-氨基丁酸的合成，使中枢抑制作用加强，从而起到缓和应激的作用[2]。同时甜菜碱提供甲基后生成Gly。本实验发现甜菜碱可使Gly的含量及GlyR的表达增加，从而发挥其抗抗癫痫作用。其作用大于丙戊酸钠。

丙戊酸钠为广谱抗癫痫药其作为抗癫痫首选的地位仍不可替代，但是其作用机制并不清楚，可能是与脑内抑制性神经递质γ-氨基丁酸浓度升高有关。但是丙戊酸钠在抗癫痫的同时有着诸多不良反应，包括体重增加、脱发、恶心、呕吐、肝中毒、胰腺炎、恶血质、骨骼的无机物脱失、闭经、不孕和致畸。对肝脏的毒性作用发生率为万分之一，属特质性反应，与剂量无关，以不适、虚弱、思睡、面部浮肿、厌食和呕吐为先驱症状。发作后有消化道和非消化道两组症状，消化道症状包括厌食、恶心、呕吐、腹痛和黄疸；非消化道症状包括嗜睡、水肿和出血倾向，此时应停药、查肝功能。美国的丙戊酸钠产品信息己将肝中毒归入黑匣子[9]。本实验中丙戊酸钠使同型半胱氨酸降低是由于丙戊酸钠对细胞色素P450系统有抑制作用，从而使血中Hcy水平降低[10]。这也可能是丙戊酸钠抗癫痫的机制之一。

本实验结果表明甜菜碱可以通过降低大鼠血清中同型半胱氨酸的含量，增加甘氨酸的含量及其受体的表达，而发挥抗癫痫的作用；而甜菜碱是一种无毒、无害、无污染的药物，因此在临床应用上有着非常广阔的前景。

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EffectsofbetaineonexpressionofGFAP,glycineandglycinereceptorinhippocampusofpentylenetetrazole-inducedepilepticrats

WANG Hui1, WANG Shu-xiang1, CUI Guo-li2, LU Chun-feng1, LIU Lei1, LIU Jun-xing1, MA Xiao-ru1, WANG Fang-fang1, LIANG Yan-feng1, WU Jia-mei1, MAO Jin-jun1, WANG Shu-qiu1

(1DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences,JiamusiUniversity,Jiamusi154007,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002,China.E-mail:wang_shuq@163.com)

AIM: To study the effects of betaine on glial fibrillary acidic protein (GFAP), glycine (Gly) and glycine receptor (GlyR) expression in the hippocampus of rats with epilepsy induced by pentylenetetrazole (PTZ).METHODSForty-eight healthy male Wistar rats were randomly divided into control group, PTZ (35 mg·kg-1·d-1, intraperitoneal injection) group, PTZ+betaine (450 mg·kg-1·d-1, intragastric administration) group, PTZ+betaine (225 mg·kg-1·d-1, intragastric administration) group, PTZ+betaine (112.5 mg·kg-1·d-1, intragastric administration) group and PTZ+sodium valproate (200 mg·kg-1·d-1, intragastric administration) group. The rats in control group were intraperitoneally injected with saline at the same volume as PTZ injection, and those in control group and PTZ group

intragastric administration of saline at 1.0 mL·d-1. Rat behavior was recorded. Serum homocysteine (Hcy) level was measured. The expression of GFAP in the hippocampus was measured by immunofluorescence. Hippocampal Gly content was measured by an amino acid analysis system. The expression of GlyR was detected by immunofluorescence and Western blotting.RESULTSThere was no difference in the latency of grand mal seizures among groups (P>0.05). However, betaine treatment significantly decreased the duration of the first grand mal seizure compared with PTZ group (P<0.01). Serum Hcy level in PTZ group was significantly lowered compared with control group (P<0.01), and further decreased after betaine treatment (P<0.05). GFAP in PTZ group was significantly higher than that in control group (P<0.01), and decreased after betaine treatment (P<0.05). Gly in PTZ group was significantly lowered compared with control group (P<0.01), and increased after betaine treatment (P<0.05). The content of GlyR among groups showed the same trend as Gly.CONCLUSIONBetaine treatment shows antiepileptic effect, which may be related to its effects on the metabolites of Hcy and Gly.

Betaine; Epilepsy; Homocysteine; Glial fibrillary acidic protein; Glycine; Glycine receptors

R363

A

1000- 4718(2013)09- 1657- 05

2013- 01- 04

2013- 07- 16

国家自然科学基金资助项目(No.81241112)；黑龙江省研究生创新基金资助项目(No. YJSCX2011-375HLJ);黑龙江教育厅科学技术研究项目(No.11521276)

△通讯作者 Tel： 0454-8623638; E-mail: wang_shuq@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.021