改进荧光法研究氟洛芬与牛血清白蛋白的相互作用

种宝红，刘保生，李志云，曹世娜

(河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002)

1 引 言

目前，在利用荧光法研究药物与蛋白相互作用方面，广泛采用的是以牛血清白蛋白(BSA)为检测对象的经典荧光法［1-2］，主要利用色氨酸残基(Trp)的荧光变化信息来代表BSA 与药物之间相互作用的整体信息［3］。然而，BSA 是由近600个氨基酸组成的多肽链，其中仅在134 和212 位上有两个Trp 残基。一些药物分子可能会与其他的氨基酸残基结合，却由于所结合氨基酸残基的荧光太弱或没有荧光而无法表现出来，此时经典荧光光谱法所表现出来的信息就是不全面、不准确的。而药物的荧光光谱所反映的信息是药物整体分子的性质。因此，以药物为检测对象，考察体系中BSA 对其荧光性质的影响，就能获得二者更准确且更全面的相互作用信息，即本文采用的改进荧光光谱法［4］。

氟洛芬为白色或类白色结晶性粉末，是动物专用的广谱抗生素，主要用于猪、牛、鱼及禽类的治疗［5］。为了解氟洛芬在血浆中游离药物浓度的变化规律，研究其与血浆蛋白的结合，本文用经典荧光法、改进荧光光谱法以及紫外光谱法对其与BSA 的相互作用机制进行了研究，并将3 种方法所得结论进行比较，对氟洛芬与BSA 之间的作用方式进行了更加准确的推测。

2 实 验

2.1 仪器与试剂

实验仪器包括:岛津制作所的RF-5301PC 荧光光度计及UV-265 紫外光度计，上海雷磁仪器厂pHS-3C 型精密酸度计，南通科学仪器厂CS501型超级恒温水浴。

牛血清白蛋白(BSA，纯度≥99%，Sigma 公司)配成浓度为1.0 ×10－5mol/L 的水溶液;氟洛芬(Fluprofen)标准品(FF，优级纯，纯度≥98%)配成1.0 ×10－3mol/L 的水溶液，用时适当稀释;含0.15 mol/L NaCl 的pH 为7.40 的Tris-HCl 缓冲溶液。

2.2 实验方法

2.2.1 经典荧光光谱法

分别在293，303，310 K 下，于一组10 mL 比色管中分别加入1.0 mL 缓冲溶液、0.3 mL 1.0 ×10－5mol/L 的BSA 溶液、不同体积的FF 溶液，用二次石英蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置30 min。在激发波长为280 nm、狭缝均为5 nm 时，记录340 nm 处的荧光值或荧光光谱。

2.2.2 改进荧光光谱法

在4.0 mL 1.0 ×10－4mol/L 的FF 溶液中加入不同体积的1.0 ×10－5mol/L BSA 溶液，在激发波长为265 nm 时，扫描发射光谱，其他同2.2.1。

2.2.3 紫外吸收光谱法

同2.2.2，以相应浓度的BSA 溶液做参比，考察200～350 nm 范围内不同浓度的BSA 对FF 紫外吸收光谱的影响，记录225 nm 处的吸光度A。

3 结果与讨论

3.1 FF-BSA 体系的经典荧光光谱

以BSA 为检测对象，考察BSA 与FF 之间相互作用的机理，结果见图1。由图1 可见，随着FF浓度的增加，BSA 在340 nm 处的荧光强度不断下降，说明FF 猝灭了BSA 的荧光。按Stern-Volmer方程［6］处理所得数据:

通过F0/F-［L］图可得到体系猝灭速率常数，列于表1。从表1 可知，随着温度的升高，Ksv依次减小，由此可推断该反应过程为静态猝灭过程［7］。且FF-BSA 体系在不同温度下的Kq值均大于2.0×1010L·mol－1·s－1［8］，进一步说明FF-BSA 体系的荧光猝灭属于静态猝灭。

对于静态荧光猝灭过程，采用式(2)［9］计算体系的结合常数Ka以及结合位点数n:

图1 BSA-FF 体系的荧光光谱(T=298 K，λex=280 nm)。Fig.1 Fluorescence spectra of FF-BSA system (T=298 K，λex=280 nm).

表1 不同温度下FF 与BSA 的猝灭反应参数Table 1 Quenching reactive parameters of FF and BSA at different temperatures

其中［L］为猝灭剂的浓度。以lg ［(F0－F)/F］对lg［L］作图，由曲线的截距和斜率即可求得体系的Ka和n，见表1。由表1 可见，随着温度的升高，Ka降低，更加证明FF-BSA 体系的荧光猝灭为静态猝灭过程。

3.2 FF 与BSA 的改进荧光光谱

以FF 为检测对象，考察药物与BSA 的相互作用，结果见图2。由图2 可以看到，FF 荧光峰在289 nm 处，随着BSA 的不断加入，体系在289 nm处的荧光强度呈加强趋势。但这并不是由荧光的敏化增强所导致的，而是因为FF 的荧光与BSA的荧光交叠情况严重，FF 的荧光与BSA 荧光产生叠加的结果。因此，本实验以相应浓度的BSA溶液作空白以排除干扰。处理后的谱图如图3 所示，可以看出随着BSA 浓度的增加，FF 在289 nm处的荧光强度依次猝灭。按照式(1)、(2)计算不同温度下的猝灭参数，结果列于表1。

图2 FF-BSA 体系的荧光光谱(T=298 K，λex=265 nm)。Fig.2 Fluorescence spectra of FF-BSA system (T=298 K，λex=265 nm).

由表1 对比可知，FF-BSA 体系的Ksv及Ka均随着温度的升高而降低，体系发生了静态猝灭，说明无论以BSA 还是药物FF 为检测对象，得到的蛋白与药物之间相互作用的机理是一致的。FF 与BSA 的结合位点数约为1，而且比传统荧光法所得到的数值略大。且相同温度下，改进法得到的结合常数均比经典法得到的结合常数值大，表明BSA 肽链中除了位于212 位上的色氨酸残基外，其他的残基也同FF 发生了相互作用。即FF 与BSA 的作用方式除了FF 与212 位色氨酸残基间“点对点”的作用方式以外，还有FF 与BSA 疏水区其他残基间“点对面”的作用方式［10］。这说明相对于经典法以蛋白为检测对象而言，以药物为检测对象能够更全面且更准确地表达蛋白与药物的相互作用信息。

图3 FF-BSA 体系的荧光光谱(扣除BSA)Fig.3 Fluorescence spectra of FF-BSA system (fluorescence of BSA deducted)

3.3 FF-BSA 体系的紫外光谱

蛋白质与药物的结合常数Kb与体系的吸光度值存在以下关系［11］:

其中A0、A 分别为无、有猝灭剂时的吸光度值;［L］为猝灭剂的浓度。以FF 为检测对象，考察药物与BSA 的相互作用，结果见图4。由图4 可知，随着BSA 浓度的增加，FF 在波长225 nm 处的吸收峰强度有规律地减弱并发生红移，表明BSA 与FF 发生了相互作用。根据式(3)，由(A0－A)－1对［L］－1作图计算体系的Kb，其结果见表2。由表2 可知Kb随温度增加而下降，与荧光法得到的结论相同，Kb值与改进法Ka接近，证明了改进法的正确性。结合常数的差异可能是由荧光法与紫外法方法上的差异所造成的。

图4 FF-BSA 体系的紫外吸收光谱Fig.4 Absorption spectra of FF-BSA system (T=293 K)

表2 紫外吸收光谱法测得FF-BSA 体系不同温度下的结合常数Table 2 The binding constants of FF-BSA system by UV absorption spectrometry at different temperatures

3.4 FF 与BSA 之间的作用力类型

生物大分子与药物间相互作用的热力学参数可以通过下式计算［12］:

温度变化不大时，可以将反应的焓变ΔH 看作定值［13］，根据体系在不同温度下的结合常数K，以RlnK 对T－1作图，得出FF-BSA 体系的热力学参数，结果见表3。药物与蛋白之间的结合能否自发进行取决于体系的ΔG，而焓变的减少或者熵变的增加，都有利于反应的自发进行。由表3 可知，利用3 种不同的方法得到该体系的热力学参数均为ΔG＜0，ΔS ＞0，ΔH＜0，表明FF 与BSA 反应可以自发地进行，FF 与BSA 之间的相互作用力主要是静电引力［14］。比较经典法与改进法及紫外法的ΔG 以及ΔS 的数值，可知以FF 为检测对象反应更容易进行。改进法和紫外法得到的热力学参数很接近，表明利用改进法研究BSA-FF体系的相互作用机理是准确的。

表3 不同温度下FF-BSA 体系的热力学参数Table 3 The thermodynamic parameters of FF-BSA at different temperatures

3.5 药物协同性

Hill 系数nH能够用来定量分析蛋白质与配体结合的协同性［15-16］:

其中，K 为结合常数，Y 为结合饱和分数。

在荧光实验中:

在紫外吸收实验中:

式中，1/Qm为以1/Q 对1/［L］作图的截距。再根据式(6)，以lg［Y/(1－Y)］对lg［L］作图，得出FF-BSA 体系的nH值，结果列于表4。由表4可知，各温度下的nH均大于1，表明FF 与BSA结合过程中，随着FF 不断结合到结合位点上，后继配体与BSA 的亲和性不断加强，表现为正协同效应即正协同性［17］，但其正协同性较弱。同时，随着温度的升高，体系的nH降低，说明温度升高时后继配体与BSA 的亲和性降低，这与前面得到的“BSA-FF 体系的结合常数随着温度的升高而降低”结论相一致。3 种方法所得nH值接近，也证明了改进法的正确性。

表4 不同温度下FF-BSA 体系的Hill 系数Table 4 Hill coefficient of FF-BSA systems at different temperatures

4 结 论

利用经典荧光法以及改进荧光法对药物FF与BSA 之间的相互作用进行了研究，并通过紫外光谱法对后者进行了验证。通过比较可知，与经典荧光法相比，改进法与紫外法所得到的结合常数较大，且两者的数值接近。这说明以药物为检测对象的改进荧光法能够更全面更准确地将蛋白与药物相互作用的信息通过荧光手段表现出来。两种方法的线性拟合方程的线性相关系数值均在0.99 以上，虽然改进法与紫外法所得出的结合常数有一定的差异，但是差异较小，这也说明改进法是合理的。改进荧光法对一直被人们沿用的经典荧光法是一个挑战，为能够更准确地研究药物与蛋白之间的相互作用提供了新的途径，能够使得蛋白与药物间的研究得到进一步完善。

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