顶空气相色谱法测定水飞蓟素中残留溶剂的研究

中国医学科学院药物研究所 北京协和药厂（100050）刘冬 何秀峰 王爱国

中国医科大学附属第一医院（110001）田昕Δ

水飞蓟素为菊科药用植物水飞蓟（Silybum marianumGaretn.）的干燥果实经有机溶媒提取、精制而成的植物提取物，呈黄色粉末或结晶状粉末，味苦；易溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醇、难溶于氯仿，不溶于水。主要成分有水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭等黄酮类物质，被称为“天然的保肝药”。水飞蓟素具有保护肝脏细胞免受毒性物质侵害、抗氧化、抗辐射等功效，是治疗肝病应用最为广泛的中药提取物之一。目前，水飞蓟素的剂型大部分为口服制剂，如水飞蓟素片、益肝灵片及软胶囊、水飞蓟宾卵磷脂复合物硬胶囊等，日服用剂量在300mg以上。

水飞蓟素的国家药品标准WS-10001-（HD-0600）-2002中未规定其残留溶剂的检测，根据其溶解特性，不同厂家的提取工艺、涉及的有机溶剂存在一定差别，主要有丙酮、乙醇以及乙酸乙酯。《中国药典》2010年版[1]及ICH（人用药品注册技术要求国际协调会）均规定了其溶剂残留的限度为：乙醇、丙酮以及乙酸乙酯均不得过0.5%。笔者对于不同提取工艺中可能用到的溶剂乙醇、丙酮以及乙酸乙酯进行了控制，建立了水飞蓟素的残留溶剂测定法，经验证该测定方法符合《中国药典》2010年版中“有机溶剂残留”测定的有关规定，各组份的分离度均符合要求；经过采用3个不同厂家共计9批次产品的检测，表明该方法操作简便，结果准确可靠。

1 仪器与试剂

Agilent6890N气相色谱仪，Agilent7689E顶空进样装置，配有Agilent操作控制及积分软件；Mettler Toledo AG285分析天平。

甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜均为色谱纯；样品为水飞蓟素（购自A、B、C三个不同中药提取公司，共9批次）。

2 色谱条件与系统适用性研究

色谱柱为HP-5弹性石英毛细管柱（30m×0.53mm，i.d，5.0µm），进样口温度为180℃，采用氢火焰离子化检测器（FID），检测器温度为250℃。柱温采用程序升温，初始温度40℃，保持6min，以15℃/min升至180℃，保持3min，载气为氮气，流速为1.7mL/min，分流比为1∶10。顶空预热温度为85℃，预热时间为20min，传输管温度为95℃，进样口温度为105℃[2]。

附表 9批水飞蓟素的残留溶剂含量测定结果（n＝2）

3 内标溶液及对照溶液的制备

取甲醇适量，精密称定，加二甲基亚砜溶解并定量稀释成每1.0mL约含甲醇3mg的溶液，作为内标溶液。取色谱纯乙醇、丙酮、乙酸乙酯适量，分别精密称定，加内标溶液溶解并定量稀释成每1mL中约含乙醇、丙酮、乙酸乙酯均为2.5mg的溶液作为对照溶液。

4 供试品溶液的配制

称取供试品0.5g，精密称定，置顶空瓶中，加入内标溶液1.0mL使其溶解，密封，预热后取顶空瓶上部气体进样。

5 空白试验

取1.0mL内标溶液置于顶空瓶中，采用上述色谱条件进样测定，色谱图中除内标物质甲醇、溶剂二甲基亚砜两个主要色谱峰外无其他明显色谱峰出现，且在乙醇、丙酮、乙酸乙酯出峰处无干扰。

6 线性关系的考察

精密称取乙醇、丙酮以及乙酸乙酯各约200.0mg至1 0 m L容量瓶中，以内标溶液稀释至刻度摇匀，作为标准溶液1，精密量取5 m L 标准溶液1 置于另一1 0 m L 容量瓶中并加内标溶液稀释至刻度，摇匀，作为标准溶液2，依此类推，分别稀释配制成含乙醇浓度为5.0、2.5、1.25、0.625、0.25、0.025µg/mL系列浓度的标准溶液6瓶，各精密量取1.0mL置6个顶空瓶中，照上述方法进行测定，记录色谱图，通过积分确定峰面积，以浓度为横坐标，以乙醇、丙酮、乙酸乙酯与甲醇峰面积的比值为纵坐标，进行线性回归。得到：残留溶剂乙醇、丙酮、乙酸乙酯的浓度在0.025～20.0µg/mL范围内，线性较好，回归方程如下：

乙醇：Y＝-0.03053+0.4137C，r＝0.9999

丙酮：Y＝-0.03421+1.9743C，r＝0.9999

乙酸乙酯：Y＝0.032406+1.5092C，r＝0.9999

7 最小检测限

本方法各溶液中乙醇、丙酮、乙酸乙酯的最小检测限（S/N＞3）分别为3.0、3.0、1.0µg/mL。

8 精密度试验

分取对照溶液各1.0mL于6个顶空瓶中，依次进样。记录峰面积值，计算相对标准偏差，乙醇、丙酮、乙酸乙酯分别为0.13%、0.79%、0.60%，精密度良好。

9 准确度试验

称取同一批号的水飞蓟素样品约0.5g于顶空瓶中，共称6份，精密加入配好的对照溶液各1.0mL，各份样品按上述方法进行测定，计算平均回收率（n＝6），乙醇、丙酮、乙酸乙酯分别为98.30%（RSD＝0.82%）、97.62%（RSD＝1.1%）、96.89%（RSD＝1.4%），表明方法的准确度较好。

10 样品的测定

称取水飞蓟素样品3个厂家共计9批次产品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，采用上述色谱条件测定样品中有机溶剂残留量，结果见附表。

11 讨论

11.1 溶剂的选择 水飞蓟素为菊科植物水飞蓟的干燥果实经有机溶媒提取、精制得到，以水飞蓟宾、异水飞蓟宾等成分为主的黄酮类物质，其易溶于丙酮、乙酸乙酯、乙醇，难溶于氯仿，不溶于水。考虑到这一点，笔者在方法选择过程中，以二甲基亚砜为溶媒，以甲醇为内标物质，采取顶空进样法，预热使样品完全溶解后进行测定，得到了比较满意的效果。

11.2 测定结果的讨论 经测定3个水飞蓟素生产厂家的9批次样品测定结果可以看出，其提取工艺、所使用的提取溶剂存在一定差别，且B厂家的产品丙酮含量超过规定限度（0.5%）。水飞蓟素日服用剂量较高，为更好的保障制剂产品安全、有效，建议在现有国家标准中增加残留溶剂的检测，以保障生产药品的安全性。

综上所述，本文所建立的气相色谱条件可同时测定水飞蓟素中的乙醇、丙酮、乙酸乙酯的含量，方法简单可靠，可以保障生产药品的安全性。