心肌细胞肥大中番茄红素对自噬的作用

汪海宁 李吉林 姚怀齐 杨宝军 徐 坦

汕头大学医学院第一附属医院，广东汕头 515041

番茄红素（lycopene，Lyc）是一种广泛存在于红色水果和蔬菜中的天然生物色素，属于类胡萝卜素一族，因最早发现于番茄中而得名[1]。目前国内外大量的研究证明Lyc不仅有极强的抗氧化能力[2]，还具有抑制炎症因子表达、抗癌、预防衰老等多种生物学效应[3-4]。虽然，近年来有少量关于Lyc可以防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制动脉粥样硬化等文献报道[5-6]，但到目前为止，未见有关于其在心肌肥大方面的作用和机制的研究。因此，探索其内在的作用机制对于寻找预防和控制高血压等心脏肥大疾病的临床有效治疗具有重要的意义。

心肌肥大的本质是细胞合成代谢与分解代谢的失衡，机体主宰分解代谢的途径主要有自噬。自噬（autophagy，Atg）是广泛存在于真核细胞中一个保守的生物学现象，它是通过包裹待降解物形成自噬体，然后与溶酶体结合进行多种酶的消化及降解，参与机体受损细胞器和蛋白质的清除，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新、维持内环境稳定的重要方式[7]。微管相关蛋白1轻链 3（tiny tubes related proteins 1 light chain 3，LC3）是自噬的特异性蛋白，分为胞质型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ，后者是LC3的活性形式[8]。在既往的研究中[9]，笔者已经证实在心肌肥大中自噬受到抑制，阻断自噬会促进心肌肥大的发展，而Lyc是否对心肌肥大产生作用，其作用是否与自噬相关尚未明确；本研究旨在AngⅡ诱导的心肌肥大中明确Lyc的作用，探讨Lyc和自噬的关系。

1 材料

1.1 动物

SD乳鼠，清洁级，1～2日龄，汕头大学医学院实验动物中心提供（SCXK粤2012-0017）。

1.2 主要试剂

DMEM-F12培养基（SH30023.01B）和胎牛血清（SV30087.01）（Hyclone）；胰蛋白酶（25200056）和Ⅰ型胶原酶 （B1067）（Gibco）；5-溴脱氧尿嘧啶核苷 BrdU（B5002），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）（A9525）和 3-甲基腺嘌呤 3MA（M9281）（Sigma）；Lyclycopene（L9879-10MG）（Sigma-Aldrich）；微管相关蛋白1轻链3 LC3Ⅰ/Ⅱ抗体（3868s），Bclin1 抗体（3738s）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GADPH（2118s）（Cell Signaling Technology）；羊抗兔 IgG-HRP（SA00001-2）（PTG，proteintech group），免疫印迹发光液 （WBKLS0100）（Millipore）， 四氢呋喃（THF） （tetrahydrofuran） 和 2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）（butylated hydroxytoluene）（上海宝曼生物科技有限公司）；无核酶水（9012），逆转录酶（DR100A），RNA酶抑制剂+脱氧核糖核苷酸混合物（RR02MA）（Takara）。

2 方法

2.1 原代心肌细胞分离和培养

消毒乳鼠，开胸取心脏，用D-Hank's溶液去血污，分离心室。置入离心管，剪碎1 mm3大小，加入0.125%的胰酶 37℃消化10 min，弃上清，放入 0.05%Ⅰ型胶原酶，37℃振荡消化2 h。用上述胰酶重复消化1～2次，每次约6 min。将细胞悬液集中放入含10%胎牛血清培养基，均匀接种到培养皿，放置于5%CO2的培养箱60 min以分离成纤维细胞。以1×106/mL密度接种于6孔板，加入100 U/mL链霉素和青霉素防止污染，及0.1 mmol/L的Brdu抑制成纤维细胞生长，最后放入50 mL/L CO2培养箱内培养。接种24 h后80%的细胞生长成片并有规律搏动时，换无血清DMEM处理24 h后分组干预。在予以Lyc处理前，先将Lyc溶解于含有 0.025%丁基羟基甲苯（BHT）的四氢呋喃。其在培养基中的浓度控制在0.05%（V/V），不会影响细胞活性。

2.2 细胞实验分组

首先在 AngⅡ（1 μmol/L）诱导的心肌肥大中，观察Lyc（5 μmol/L）对细胞的作用，将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc 组（5 μmol/L）和Lyc组（5 μmol/L）；于 48 h检测心肌肥大的标志物ANP的mRNA表达水平。为观察心肌肥大时Lyc（5 μmol/L）对自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白的影响，将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc 组（5 μmol/L）和 AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）组+3-MA（5 μmol/L）组；于 48 h 以 Western blot法测定Beclin1和LC3蛋白的水平。

2.3 细胞镜检

用AngⅡ和（或）Lyc干预48 h的心肌细胞以4%PFA固定，显微镜400倍拍照，每组取50个同样大小视野，利用图像分析软件Image pro plus 6.0计算细胞面积[9]。

2.4 Western blot检测蛋白的表达

冰上裂解细胞30 min，收取蛋白。取总蛋白进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白以80 V，100 min转至 PVDF膜上；用 50 g/L的 BSA封闭 1 h，加 LC3B抗体（1∶1000）、GADPH 抗体（1∶10 000）4℃孵育过夜；次日用TBST洗膜，与辣根过氧化物酶标记的抗体（1∶10 000）室温孵育 1 h；用 ECL显影、曝光。采用图像分析软件检测蛋白条带的灰度值，LC3Ⅱ与LC3Ⅰ条带的比值代表LC3蛋白的表达水平，其余以GAPDH作为参照[9]。

2.5 实时定量PCR

常规Trizol裂解法提取mRNA并逆转录成cDNA。参照文献[9]做标准曲线和定量PCR体系。在Roche PCR分析仪器里扩增目的基因，反应条件为：94℃预变性 5 min，然后 94℃ 15 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共 30 循环，72℃ 6 min。反应结束后，使用PCR仪配套软件进行分析。重复3次，数据进行统计学分析。引物序列：ANP：上游引物5'-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3'，下游引物5'-AGGCCAGGAAGAGGAAGAAG C-3'；GAPDH：上游引物5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物 5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。

2.6 统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，各组之间的差异用One-way ANOVA比较均值的单因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用

本研究从心肌细胞形态、细胞面积及心肌肥大标志物水平这三个方面，明确Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用。将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）和 Lyc（5 μmol/L）组；结果显示，与对照组比较，AngⅡ刺激48 h后细胞面积增大（P＜0.01），心肌肥大标志物ANP的mRNA水平上调（P＜0.01）；Lyc结合 AngⅡ干预，细胞大小和面积明显减小（P＜0.05），ANP的mRNA比值显著下降（P＜0.05）；而用 Lyc本身对心肌细胞大小和形态无明显作用（P＞0.05），ANP的mRNA比值无显著影响（P ＞ 0.05）（图1、表1）。 提示 Lyc可抑制 AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

图1 Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用

表1 四组大鼠心肌细胞面积和ANPmRNA测定结果比较（±s，n=5）

表1 四组大鼠心肌细胞面积和ANPmRNA测定结果比较（±s，n=5）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与 AngⅡ组比较，#P＜0.05

组别 细胞面积（像素） ANP的相对含量对照组260.50±26.486.35±0.99 AngⅡ组517.19±52.31**17.83±2.07**AngⅡ+Lyc组355.82±40.45#12.16±1.41#Lyc组254.09±27.635.60±0.87 F值56.518157.048 P值 ＜0.05＜0.05

3.2 在心肌肥大中Lyc对自噬的作用

为明确在心肌肥大中Lyc对自噬的作用，将细胞分为四组：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc 组（5 μmol/L）和 AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）组+3-MA（5 μmol/L）组；于48 h以Western blot法测定Beclin1和 LC3蛋白的水平，LC3Ⅱ/Ⅰ反应自噬活性。结果显示：与对照组比较，AngⅡ干预 48 h后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平下降（P＜0.05），加入 Lyc干预后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平有所增加 （P＜0.05），而使用 3-MA后 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和 Beclin1的蛋白水平迅速下降（P ＜ 0.01）；3-MA（5 μM）对细胞本身无影响（图2、3，表2）。

图2 在心肌肥大中Lyc对LC3蛋白的影响

图3 在心肌肥大中Lyc对Beclin1蛋白的影响

4 讨论

从20世纪末人们发现服用Lyc能明显降低前列腺癌的发病率至今，已有大量的流行病学调查、临床研究和动物实验证明Lyc具有极强的抗氧化能力，可以预防各种慢性疾病[8-10]。特别是在心血管疾病中，Lyc不仅可以降低血脂，降低收缩压，减少心血管疾病的风险，还能缓解缺血/再灌注损伤[11-12]。但对于其是否有抑制心肌肥大的作用及相关机制，目前国内尚未有报道。本实验首次在心肌肥大的模型上探讨Lyc的作用和与自噬之间的关系。本实验观察到，AngⅡ干预心肌细胞后细胞面积明显增大、心肌肥大标志物心房利钠多肽（ANP）明显上升，说明AngⅡ诱导的细胞肥大模型成功；然后加入Lyc干预发现，Lyc减少了AngⅡ诱导心肌细胞面积的增大，降低了ANP的升高，在一点程度上对心肌肥大起到了抑制作用。实验进一步发现，AngⅡ诱导的细胞肥大中伴有自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白表达的下降，而Lyc的干预却促进了自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白的表达。利用自噬阻断剂3MA降低了Lyc对心肌细胞肥大的抑制作用，提示Lyc可能通过激活自噬来抑制AngⅡ诱导的心肌肥大。

表2 四组大鼠心肌LC3和Beclin1蛋白测定结果比较（±s，n=5）

表2 四组大鼠心肌LC3和Beclin1蛋白测定结果比较（±s，n=5）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与 AngⅡ组比较，#P＜0.05；与 AngⅡ+Lyc组比较，**P＜0.01

组别 LC3蛋白相对含量 Beclin1蛋白相对含量对照组0.671±0.0520.734±0.067 AngⅡ组0.408±0.041*0.451±0.053*AngⅡ+Lyc组0.608±0.045#0.685±0.058#AngⅡ+Lyc+3-MA 组0.219±0.023**0.347±0.049**F值177.114202.873 P值 ＜0.05＜0.05

自噬在心脏中的作用存在着争议。早在20世纪80年代，人们就发现心肌细胞蛋白质合成增加和细胞肥大的同时，伴随着自噬水平的降低[13]。21世纪初Nakai等[14]在横主动脉缩窄诱导的早期心肌肥大模型中发现，自噬水平明显低于假手术组，提示心肌肥大代偿期，自噬活性显著下降；此外亦有文献报道自噬的激活剂雷帕霉素可以阻断由主动脉缩窄[15]、甲状腺激素[16]引起的心肌肥大，并且逆转已经存在的心肌肥大[17]。最近的研究发现，FoxO3可通过上调自噬水平，使心肌肥大的心脏体积缩小[18]。目前关于Lyc对自噬的作用在心脏病中的研究是空白。笔者前期实验表明自噬对于AngⅡ诱导的心肌肥大发展可能起抑制作用[9]。本实验在细胞水平上明确了Lyc具有抗心肌肥大和提高自噬水平的作用，而阻断自噬会明显降低Lyc对细胞肥大的影响，提示自噬可能是Lyc抑制心肌肥大的一个重要环节，而Lyc是如何调控自噬，其具体分子机制仍需进一步的研究和探索。

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