酸奶中杆菌和球菌的快速分离及发酵剂的制备

付 鸿，李靖靖，岳 春

（1.中州大学化工食品学院，河南 郑州450044；2.南阳理工学院生物与化学工程学院，河南 南阳473004）

近年来，随着人民生活水平的提高和健康意识的增强，我国发酵酸乳制品工业迅猛发展[1］。酸奶以其独特的风味和特有的保健功能越来越受到人们的喜爱，其产量正以每年25%的速度递增[2］，这对酸奶发酵剂的品质、特性、种类提出了新的要求。目前，我国酸奶发酵剂的制备大多停留在传统人工型发酵剂水平上，一般需要配备专门菌种室、专业人员、专用设备，存在工序多、周期长、菌种容易污染和退化等缺点，导致酸奶质量不稳定，影响了企业的信誉和酸奶产业的发展[3］。

要获得良好的酸乳制品，其发酵菌种中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例一般应为（1～2）∶1，但由于两者的生长要求和耐酸能力不同，在继代培养后两者的比例会发生变化，若干代后的菌种便不能用于生产，有些甚至产生杂菌，给酸奶的风味带来很大的影响。为此，作者利用这两种菌不同的生长特性，先将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌分离，再按（1～2）∶1的比例混合培养后用于制备酸奶发酵剂，可有效地解决这一问题。

1 实验

1.1 菌种、试剂与仪器

保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌（生产发酵剂），由三色鸽乳业提供。

盐酸、NaOH、葡萄糖、酵母膏、溴甲酚绿、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，均为分析纯；脱脂乳粉、乳粉水解液，均为食品级。

YQX型厌氧培养箱、恒温培养箱、超净工作台、高压灭菌锅等。

1.2 方法

实验流程见图1。

图1 实验流程Fig.1 Experimental process

1.2.1 乳酸菌混合菌种的活化

按1∶7（质量体积比）的比例将脱脂乳粉和水配成复原牛奶600mL，加入15g蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～15min，然后冷却至40℃，在无菌操作下，等量装入3个250mL的锥形瓶中，接入5%的乳酸菌混合菌种，置于42℃恒温培养箱中培养4h，取出，连续活化两代后备用。

1.2.2 乳酸菌混合菌的分离[4，5］

乳酸菌混合菌分离培养基：牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，蕃茄汁20%，吐温－80 0.05%，CaCO32g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH 值6.5，于121℃灭菌20min，备用。

取活化乳酸菌混合菌种1mL加入到9mL无菌水中，依次用10倍法稀释至10－6；取各个稀释度菌液1mL与已灭菌的培养基制成混合平板；将制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保温42℃，培养2～3d，挑选单个菌落，接种于液体培养基中，用无菌玻璃刮铲依次涂布，或直接用接种环沾取原液，平板划线分离，于40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落且其周围培养基变为黄色者，可初步定为乳酸菌。反复进行3～5次纯化，通过检查继代培养中长出的所有菌落形态是否一致判断乳酸菌纯度，待确认为纯种后，再进行鉴定、保存。

1.2.3 保加利亚乳杆菌的分离与鉴定

将BCP培养基的pH值用1%的盐酸调至5.0，于121℃灭菌20min；无菌条件下倒平板凝固后，挑乳酸菌混合菌种划平板，将制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保温42℃，培养48h，反复进行3～5次纯化，通过检查继代培养中长出的所有菌落形态是否一致判断保加利亚乳杆菌纯度，待确认为纯种后，再进行鉴定。

1.2.4 嗜热链球菌的分离与鉴定

将BCP培养基的pH值用1%的NaOH调至9.0，于121℃灭菌20min，无菌条件下倒平板凝固后，挑乳酸菌混合菌种划平板，将制得的平板置真空干燥器中抽真空至0.08MPa，保温42℃，培养48h，反复进行3～5次纯化，通过检查继代培养中长出的所有菌落形态是否一致判断嗜热链球菌纯度，待确认为纯种后，再进行鉴定。

1.2.5 酸奶混合菌种的制备

1.2.5.1 乳酸菌种的活化与计数

活化培养基：脱脂乳粉13%，葡萄糖2%，乳粉水解液4%，酵母浸膏0.25%，溶剂为0.025mol·L－1NaH2PO4－Na2HPO4缓冲溶液（pH＝6.8）。

选择性培养基主要用于单菌分离，并非最适合生长培基。分别将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在活化培养基上于42℃活化6h，采用菌落计数法计算酸乳中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的数量。

1.2.5.2 液体菌种的混合

取1mL杆菌活化液和12.5mL球菌活化液，混合，作为酸奶混合菌种。

1.2.6 酸奶发酵剂的制备

1.2.6.1 种子发酵剂的制备

培养基：5mL 5%的石蕊液加入100mL脱脂乳（脱脂乳粉与5%蔗糖水以1∶10比例配制）移至250mL的三角瓶中。于121℃、0.15MPa灭菌20min。

接种：在石蕊牛乳上接1mL酸奶混合菌种于42℃培养箱培养至液面呈红色。

1.2.6.2 母发酵剂的制备

在250mL三角瓶中加入150mL脱脂乳（按1∶7的比例将脱脂乳粉和水配成复原牛奶，然后加入4g蔗糖）于121℃、0.15MPa灭菌20min，冷却后用已灭菌的吸管吸取1mL凝块，放入三角烧瓶中，搅拌后于42℃培养至酸度达0.8%～1.0%。

1.2.6.3 工作发酵剂的制备

将新鲜牛乳于90～95℃ 巴氏杀菌30～60min，冷却至42～45℃，无菌条件下接种2%母发酵剂，培养4～6h，冷却后熟即得菌种。

将新鲜牛奶过滤，于95℃巴氏杀菌10min，冷却至45℃，接种3%的上一步菌种，发酵4h，后熟12h，即得工作发酵剂。经测定，其活力为0.85%。

1.3 分析检测

1.3.1 活力测定[6］

活力检查：使用前在化验室对发酵剂的活力进行检查，依据发酵剂的酸生成状况或色素还原情况进行判断（好的酸乳发酵剂活力一般在0.8%以上）。

活力测定：在灭菌冷却后的脱脂乳中加入3%的发酵剂，于37.8℃恒温箱中培养3.5h，测定酸度，若滴定乳酸度达0.8%以上，认为活力良好。

1.3.2 乳酸菌计数

采用血球板计数法[4］计算乳酸菌。

1.3.3 乳酸菌的镜检[4，7］

采用特殊的染色法——甲苯胺蓝染色法，即涂片固定后，用0.2%的甲苯胺蓝染色液染色2min，再用1%的乙酸溶液脱色数秒，即可使涂片中的菌体着染蓝色，而且背景呈现白色或无色，菌体形状十分清晰，即使涂片很厚且不匀也能看清菌体，便于菌体细胞计数和形体观察。通过甲苯胺蓝染色观察分离培养的乳酸菌，根据乳酸菌的性质，看是否有其它杂菌，若有，挑取变为黄色的菌落，继续划平板培养，直到镜检全是乳酸菌为止。

2 结果与讨论

2.1 保加利亚乳杆菌分离培养基pH值的确定

由于保加利亚乳杆菌在pH值为5或更低的情况下可生长、嗜热链球菌在pH值较低的情况下不生长，为了确定乳杆菌能生长而链球菌不能生长的合适pH值，以保加利亚乳杆菌革兰氏染色的镜检结果及菌落生长状况为指标进行pH值单因素实验。挑取分离得到的乳酸菌菌落，接种到保加利亚乳杆菌分离培养基中，于42℃厌氧培箱中培养48h，用革兰氏染色进行镜检，结果见表1 。

表1 保加利亚乳杆菌革兰氏染色镜检结果Tab.1 Microscopic examination results of Gram－staining for Lactobacillus bulgaricus

由表1 可以看出，保加利亚乳杆菌分离培养基的pH值为5.0时，分离效果最佳。

2.2 保加利亚乳杆菌性质鉴定

保加利亚乳杆菌菌落特征为：菌落呈中等大小，微白色，湿润，边缘不整齐，如棉絮团状。属革兰氏阳性杆菌，菌体宽度小于2μm，常表现出长杆状，多呈线状，常有卷曲，幼龄时单个或成对。符合文献[8］对保加利亚乳杆菌形态的描述。

将鉴定过的保加利亚乳杆菌接种到脱脂乳中，于不同温度下培养发酵。结果发现，保加利亚乳杆菌在39～44℃时约4h凝乳；当培养温度超过44℃时，随着温度的升高，凝乳时间延长；当培养温度超过53℃时，不能凝乳；当培养温度低于39℃时，随着培养温度的降低，凝乳时间延长；当培养温度低于23℃时，不能凝乳。

分离到的杆菌在含胆汁酸盐的液体培养基、含2%氯化钠的液体培养基、含0.4%酚的培养基中均能生长，而在含0.5%酚的培养基中不能生长。进一步证明，分离到的杆菌是保加利亚乳杆菌。

2.3 嗜热链球菌分离培养基pH值的确定

由于嗜热链球菌在pH值为9.2的情况下能生长、保加利亚乳杆菌在pH值较高的情况下不生长，为了确定嗜热链球菌能生长而保加利亚乳杆菌不能生长的合适pH值，以嗜热链球菌革兰氏染色镜检结果及菌落生长状况为指标进行pH值单因素实验。挑取分离得到的乳酸菌菌落，接种到嗜热链球菌分离培养基中，于42℃厌氧培养箱中培养48h，用革兰氏染色进行镜检，结果见表2 。

表2 嗜热链球菌革兰氏染色镜检结果Tab.2 Microscopic examination results of Gram－staining of Streptococcus thermothillus

由表2 可以看出，嗜热链球菌分离培养基的pH值为9.0时，分离效果最佳。

2.4 嗜热链球菌性质鉴定

嗜热链球菌菌落特征为：菌落光滑，微白色，边缘整齐。属革兰氏阳性球菌，黄色，菌落较大，生长良好，菌落卵圆形，表面光滑，凸起，符合文献[8］对嗜热链球菌形态的描述。

将分离得到的嗜热链球菌接种到脱脂乳中，于不同温度下培养发酵。结果发现，嗜热链球菌在39～46℃时约4h凝乳；在46～50℃时，随着温度的升高，凝乳时间延长；当培养温度超过54℃时，不能凝乳；当培养温度低于39℃时，随着培养温度的降低，凝乳时间延长；当培养温度低于21℃时，不能凝乳。

分离到的球菌在含2%氯化钠的液体培养基、0.1%的镁蓝牛乳中不能生长。进一步证明，分离到的球菌是嗜热链球菌。

2.5 乳酸单菌与混合菌发酵酸乳品的性质比较（表3 ）

表3 乳酸单菌及混合菌发酵的酸乳品性质比较Tab.3 Performance comparison of yogurts fermented by Lactobacillus bulgaricus，Streptococcus thermothillus or their mixture

由表3 可知，乳酸单菌发酵效果没有球杆混合菌的效果好。

2.6 保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌配比的确定

分别取活化后的保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌1mL，用无菌水进行10倍法均匀稀释，取10－6、10－7、10－83种稀释度，用混合平板法培养，凝固后于37℃厌氧培养箱中培养，然后进行菌落计数，结果见表4。

由表4可以看出，1mL活化菌悬液中，保加利亚乳杆菌的数量是嗜热链球菌数量的25倍，因此在制发酵剂时，可以取1mL杆菌活化液和25mL或12.5mL球菌活化液进行混合，这样混合制得的发酵剂中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例可以控制在（1～2）∶1之间。

表4 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的平板计数结果Tab.4 Count results of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermothillus

2.7 工作发酵剂接种量的确定（表5 ）

表5 工作发酵剂接种量的确定Tab.5 Choose of inoculum amount of fermentation agent

由表5 可以看出，工作发酵剂接种量以3%为佳，可以制得酸味适中、香味浓郁的酸乳制品。

3 结 论

（1）利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最适pH值不同，确定了当BCP培养基的pH值分别为5.0和9.0时，能将两者有效分离。

（2）将分离开来的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按（1～2）∶1的比例混合制得酸奶发酵剂，以其作为乳酸菌菌种制得的酸乳品酸味适中、香味浓郁。

[1]万红兵，田洪涛，山丽杰，等.嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌麦芽复合汁增菌培养基的优化筛选[J］.食品与发酵工业，2006，32（6）：51－55.

[2]王俊英，张杰.酸奶中嗜热链球菌的分离和性能研究[J］.周口师范学院学报，2012，29（2）：89－91.

[3]李志成，徐怀德，王敏，等.嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌增菌培养研究[J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2002，（Z1）：50－52.

[4]凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M］.北京：中国轻工业出版社，1999：84－88.

[5]赵丽丽.乳酸菌的分离鉴定及其在酸豆乳加工中的应用[D］.北京：北京工商大学，2009.

[6]袁丽红.微生物学实验[M］.北京：化学工业出版社，2010：207－208.

[7]昌加平.酸奶中乳酸菌镜检涂片的特殊染色法[J］.微生物学通报，1996，26（4）：281－282.

[8]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M］.北京：科学出版社，2001：371－385.