ω－3不饱和脂肪酸和谷氨酰胺抗压力性氧化损伤的实验研究

王艳，高金华，周守凤，陈慧敏，郑国荣，刁波

（1.广州军区武汉总医院 消化内科，湖北 武汉 430070；2.广州军区武汉总医院神经外科研究所 医学实验中心）

目前许多研究者发现，氧自由基是引起机体衰老和疾病的致病因素［1］。自由基损伤所造成的组织氧化应激是造成压疮的重要原因之一［2］。提高体内抗氧化酶活力是消除氧自由基的最佳途径，寻找一种有效的抗氧化营养物质已成为预防老年压疮的研究热点。ω－3不饱和脂肪酸（polyunsaturated fattyacids，ω－3PUFAs）和谷氨酰胺（glutalnin，Gln）是近年来研究较多且获得公认的有效的免疫调理营养素，不但可以在体内氧化供能，而且还可以通过稳定生物膜减少氧自由基的攻击，同时可以促进蛋白合成和细胞生长，具有组织修复及增强机体免疫功能的作用［3］。本研究通过复制老年大鼠压疮模型，观察ω－3PUFAs和Gln的抗压力性氧化损伤作用，并探讨其可能的机制，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药品 Gln购自美国Amresco公司；ω－3PUFAs购自南京森海生物油脂有限公司；双蒸水为实验室自制。实验时分别将7.41gω－3PUFAs粉剂、11.7g Gln粉剂用蒸馏水稀释至27ml，配制成浓度为1.6g／（kg·d）和3.2g／（kg·d）的营养素灌胃液。

1.2 试剂 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）及一氧化氮（nitricoxide，NO），试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 动物 SPF级雄性老年SD大鼠由湖北省医学实验动物中心提供，动物生产合格证号：SCXK（鄂）2008－0004。

1.4 方法

1.4.1 实验分组 将喂养16个月的老年SD大鼠28只按随机数字表法分成4组。对照组（6只）、模型组（6只）、ω－3PUFAs干预组（A 组，8只），Gln干预组（B组，8只）。各组分别做好标记，对照组和模型组大鼠采用普通饲料自由采食和饮水方式喂养。A、B组大鼠分别采用普通饲料加配制好的ω－3PUFAs、Gln灌胃液连续喂养20d。动物饲养室的温度为22℃，湿度为50%。在实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.4.2 动物模型的制备 28只老年SD大鼠均禁食12h，用10%水合氯醛按300mg／kg腹腔注射麻醉。对照组不造模，直接颈动脉取血后处死。另3组大鼠仰卧于设计好的简易加压装置上，造模参照作者以往文献［4］的方法和参数实施。

1.4.3 组织形态学观察 将切下来的受压部位皮肤和肌肉组织标本用10%甲醛固定后石蜡包埋，切片、H－E染色，用 HMIAS－2000彩色图文分析系统采集图像，DP70光学显微镜下观察其结构及细胞浸润等特征改变。

1.4.4 10%肌肉匀浆液的制备 实验完成后放松2h，颈动脉去血，取受压部位肌肉组织于－70℃保存。冻存的样品于同一天以生理盐水配制成10%肌肉匀浆，分装并保存于－70℃条件下。

1.4.5 SOD活力的测定 黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显示剂下呈紫红色，当样品中含有SOD时，则对有专一性的抑制，颜色变浅，通过公式计算SOD的活力。具体操作参照SOD试剂盒说明书。

1.4.6 LDH漏出液测定 LDH能够在有辅酶的条件下催化乳酸形成丙酮酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷二酸，丙酮酸与2、4－二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中形成棕红色，通过比色法检测LDH漏出液。具体操作参照LDH试剂盒说明书。

1.4.7 NO含量的测定 NO化学性质活泼，在体内代谢很快转为稳定的硝酸根离子亚硝酸盐（）和硝酸盐（），本法利用硝酸还原酶特异性将还原为，间接检测就能有效反映NO的水平。采用硝酸还原酶化学比色法测定NO含量，具体操作参照NO试剂盒说明书。

1.5 统计学处理 使用采用SPSS 13.0统计软件，计量资料用x¯±s表示，采用单因素方差分析，方差齐性采用LSD法，方差不齐采用 Games－Howell法，以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠皮肤、肌肉组织的形态学改变 对照组大鼠皮肤上皮组织为复层鳞状上皮，上皮结构清晰，真皮层内附属器（如毛囊）较多且清晰可见。肌纤维排列紧密，形态正常，结构完整。与对照组相比，模型组大鼠复层鳞状上皮较薄，上皮结构自溶、断裂；肌纤维有断裂迹象，轻度水肿，间隙增宽，有蜡样变性，肌组织萎缩、变性，有自溶现象。与模型组相比，A组大鼠复层鳞状上皮结构清晰，真皮层内附属器（如毛囊）清晰可见；肌纤维排列尚紧密，横纹清晰，轻度水肿，肌组织有轻度萎缩现象。B组大鼠复层鳞状上皮较模型组上皮层次清晰，真皮层内附属器（如毛囊）清晰可见；肌纤维有轻度断裂迹象，水肿，间隙增宽，有蜡样变性，肌组织有轻度萎缩、自溶现象。

2.2 4组大鼠LDH漏出液及10%肌肉匀浆液中SOD活性及NO含量的变化 与对照组相比，模型组SOD的活性显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，A组SOD的活性显著增高（P＜0.01）；B组SOD的活性增高（P＜0.05）。与对照组相比，模型组NO含量显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，A、B组NO含量显著降低（P＜0.01）。与对照组相比，模型组LDH漏出液显著增多（P＜0.01）；与模型组相比，A组LDH漏出液显著减少（P＜0.01）；B组LDH漏出液减少（P＜0.05）。见表1。

表1 4组大鼠LDH漏出液及10%肌肉匀浆液中SOD活性及NO含量的比较（）

表1 4组大鼠LDH漏出液及10%肌肉匀浆液中SOD活性及NO含量的比较（）

与模型组比较，a：P＜0.05；b：P＜0.01

组别 只数 SOD［zB／（u·μg－1）］ NO含量［bB／（μmol·g－1）］ LDH（%）对照组 6 55.67±4.85b 2.28±0.19b 0.15±0.08b模型组 6 22.53±1.28 4.14±0.18 0.67±0.14 A组 8 35.88±5.24b 2.22±0.25b 0.40±0.12b B组 8 31.25±4.37a 2.55±0.32b 0.48±0.12a

3 讨论

3.1 自由基引发的组织氧化应激损伤是老年大鼠压疮发生的重要原因之一 压疮是临床常见的并发症之一。随着人口老龄化，卧床老年患者逐渐增多，压疮发生率呈上升趋势。相关研究［5］显示：住院老年患者的压疮发生率为10%～25%，发生压疮的老年患者病死率较未发生压疮者增加4～6倍。以往实验［4］证明：皮肤持续受压导致的氧化应激反应在压疮发生发展过程中起着重要的作用。氧化应激是指机体或细胞内以氧自由基为代表的氧化性物质的产生与消除失衡，导致氧化性物质在细胞内蓄积而引发的氧化反应状态。对于老年机体，生理状态下即有体内增龄性自由基（如NO）水平的增高和内源性抗自由基防御功能（如SOD等）的下降，使得老年机体承受氧化应激的功能贮备在生理状态下较中青年明显降低［6］，这是老年人在缺血缺氧等氧化应激状态下更易造成氧自由基产生与清除失衡，从而产生组织细胞过氧化损伤的内在基础。

本研究显示：与对照组相比，模型组SOD活性显著下降，NO含量和LDH漏出液显著增高（P＜0.01）。这可能是由于皮肤持续遭受22.47kPa压力2h以上，造成受压局部皮肤组织缺血缺氧，丙酮酸经LDH催化生成大量乳酸，导致细胞酸中毒。同时组织中磷酸肌酸和ATP迅速消耗，ATP依赖的离子泵衰竭，细胞内钙超载，黄嘌呤氧化酶系统活化，花生四烯酸所引起的链式反应激活，产生大量的自由基。NO也称氮氧自由基.，它在氧化应激状态下，与SOD有力地竞争，而形成强氧化剂过氧亚硝基阴离子，造成细胞内许多重要的蛋白质或酶失活，破坏线粒体结构，使DNA链断裂，同时启动脂质过氧化，导致组织损伤［7］。LDH的释放能间接地反映细胞的损伤情况。

3.2 ω－3PUFAs和Gln的早期应用对老年大鼠受压组织氧化应激损伤的干预作用 从研究结果可见，与模型组相比，A组SOD活性显著增高，NO含量和LDH漏出液显著减少（P＜0.01）；B组SOD活性增高、LDH漏出液及NO含量显著减少（P＜0.01，P＜0.05）。结合光镜下观察结果，提示我们：ω－3PUFAs和Glu具有抗氧化、清除自由基、增强细胞内SOD活性、抑制NO的释放等作用。经ω－3 PUFAs和Glu早期干预后，可有效降低氧化应激反应，减轻组织损伤，尤其以不饱和脂肪酸作用显著。这是由于ω－3PUFAs能有效上调抗氧化酶的基因表达，合成大量抗氧化酶如SOD、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutataione，GSH）等参与氧自由基的清除，减少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。另一方面，由于ω－3PUFAs是一种多不饱和脂肪酸，而氧自由基正是与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生过氧化，进而导致细胞膜结构和功能的损害。因此，ω－3PUFAs也可能作为一种氧自由基清除剂直接与氧自由基发生反应，保护了细胞膜及亚细胞器膜的结构和功能［8］。

而Gln作为体内含量最丰富的游离氨基酸，对细胞膜的稳定性具有广泛的保护作用，它主要通过提高GSH合成速度而增加细胞GSH的储量，GSH系统是减轻氧化应激的主要机制之一。GSH是生物体内最重要的非蛋白巯基化合物，直接或间接参与许多生物功能，保护细胞免受毒物的损害，并能提高机体解毒及增强氧化的能力。Gln作为GSH的前体物，在组织受损或缺血缺氧时保证GSH正常水平，使组织免受损伤［9］；但其抗氧化损伤作用稍逊于ω－3PUFAs。

4 小结

皮肤组织持续遭受2h以上22.47kPa压力，可诱导老年大鼠受压组织产生氧化应激反应，产生大量氧自由基，导致机体抗氧化防御系统对氧自由基的清除能力下降，造成组织损伤。ω－3PUFAs和Gln早期干预均能提高受压组织抗氧化能力，尤其是ω－3PUFAs对增强老年机体的抗压力性损伤作用较强。

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