阿司匹林对人慢性粒细胞白血病细胞株K562的生长抑制作用

王芳妹，杨子剑，韩 梅，胡 翔，丁小凤*

(1.湖南师范大学生命科学学院，蛋白质化学与发育生物学教育部重点实验室，中国长沙 410081;2.湖南省产商品质量监督检验研究院，中国长沙 410007)

慢性粒细胞白血病(CML)是一种骨髓造血干细胞恶性增殖的造血系统肿瘤，约占全部白血病的20%左右.90%以上的慢性粒细胞白血病具有Ph染色体和BCR-ABL染色体易位融合基因的表达，主要表现为白细胞持续升高和脾脏显著肿大［1］.CML的病程可分为慢性期、加速期和急变期.目前可能彻底治疗慢性粒细胞白血病的方法是移植造血干细胞，但是可供者来源有限［2］.常规化学药物和生物制剂IFN治疗的不良反应大.近年来，分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼为数万例CML患者显著延长早慢性期和IFN-α治疗失败的晚慢性期.但伊马替尼对于未分化的白血病干细胞无效，容易导致疾病复发且持续治疗费用高［3-4］.

阿司匹林是一种非甾体抗炎药，主要用于解热镇痛、抗炎和抗血小板凝集，预防冠心病、中风等心脑血管疾病发作.近来研究发现长期小剂量服用阿司匹林可以降低多种癌症的发病率［5］.阿司匹林显著抑制结肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的生长，促进细胞凋亡［6-9］.动物实验证明阿司匹林可以使人结肠肿瘤缩小到15%，而没有任何副作用［10］.阿司匹林对慢性粒细胞白血病的治疗研究却少有报道.本研究探讨阿司匹林对人慢性粒细胞白血病K562细胞株的抑制作用，并初步分析可能的分子机制，为白血病的临床治疗提供新的实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

慢性粒细胞白血病K562细胞株为本实验室保存.3～4周BALb/c品系雌性裸鼠购自湖南斯莱克景达实验动物公司.DMEM培养液、胎牛血清购于GIBCO公司.四甲基偶氮唑盐(MTT)、Hoechst 33258和阿司匹林购于Sigma公司，蛋白质分子质量标准购自 Fermentas公司.鼠抗 β-catenin、STAT5A、PARP、NF-κB p65和p21单克隆抗体购于Santa Cruz公司，鼠抗GAPDH单克隆抗体购于湖南远泰生物公司.Annexin V-FITC/PI双染色试剂盒购于美国BD公司.SuperSignal ECL发光试剂盒购于Pierce公司.其他常规试剂均购于上海生工公司.

1.2 细胞培养

人慢性粒细胞白血病K562半悬浮细胞培养于含10%(体积分数)胎牛血清、1.667 mkat/L(即105U/L)青霉素、1.667 mkat/L(即105U/L)链霉素的DMEM培养液中，置于37℃含体积分数为5%CO2的恒温培养箱中培养.

1.3 K562细胞的形态学观察

分别用0、10、20和30 mmol/L阿司匹林处理的K562细胞培养36 h后，用普通光学显微镜观察细胞形态并拍照.将余下的细胞离心收集于1.5 mL离心管，加入0.5 mL多聚甲醛(40 g/L)，缓缓悬起细胞，固定10 min.用PBS洗2遍.将细胞滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀.稍晾干，均匀滴上0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min.用PBS洗2遍.盖上盖玻片，用荧光显微镜观察细胞核.每组实验重复3次.

1.4 细胞增殖分析

1.4.1 MTT法 K562细胞在24孔板上培养至对数生长期，分别加入适当的药物处理24 h和48 h.加入50 μL MTT溶液，继续培养3～4 h后，离心，弃上清，加入二甲基亚砜200 μL，水平漩涡器振荡使结晶完全溶解，测定每孔波长490 nm的吸光值.每组实验设3个复孔，实验重复3次.

1.4.2 细胞计数法 将1×109个/L的K562细胞接种6孔板中，分别加入0、10、20和30 mmol/L阿司匹林处理24 h和48 h.将细胞用台盼蓝溶液染色，用计数板于低倍显微镜下计算各组细胞的密度.每组实验设3个复孔，实验重复3次.

1.4.3 软琼脂克隆形成实验 K562细胞经0、10、20和30 mmol/L阿司匹林处理24 h并加入含体积分数为10%FBS的DMEM的0.35%琼脂培养基，每孔2 000个细胞，共设3个平行组，轻轻转动6孔板使细胞分散均匀.置于37℃、5%CO2的培养箱中培养14 d.在低倍显微镜下计数大于30个细胞的克隆数，数码相机拍照.每组至少重复3次实验.

1.5 细胞凋亡检测

K562细胞经0、10、20和30 mmol/L阿司匹林处理36 h，收集细胞(每组至少1×106个细胞)，采用Annexin V-FITC/PI染色后上机操作，以未染色细胞进行机器调零，分别以Annexin V-FITC和PI单染管作为基准参照，测定每组细胞的数据，显示凋亡细胞的百分比.每组至少重复3次实验.

1.6 裸鼠成瘤实验

将1×107个细胞接种于8只BALb/c裸鼠背部皮下，接种后每天观察荷瘤小鼠的生长情况，当瘤体长到1 cm3左右，选取4只瘤体体积相同的裸鼠进行腹腔注射给药，实验组给予25 mg/kg的阿司匹林，对照组给予0.1 mL生理盐水，各组每两天测瘤体体积和给药1次，连续2周.末次给药24 h后以脱臼法将裸鼠处死，取出皮下移植瘤，称重和拍照.每组实验重复2次.

1.7 Western 印迹

收集0、10、20和30 mmol/L阿司匹林处理K562细胞36 h的蛋白裂解物，SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上，置于5 mL含脱脂奶粉50 g/L的TBS缓冲液中封闭1 h.加入一抗(1∶1 000稀释)，37℃孵育2 h，TTBS洗膜，5 min×4次.加入羊抗鼠二抗(1∶2 000稀释)，37 ℃孵育45 min，TTBS洗膜，5 min×4 次，ECL显色，拍照分析.

1.8 统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，数据用均数±标准差表示，实验组与对照组样本进行均数比较的t检验.以P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 细胞形态学观察

显微镜下可见正常K562细胞呈圆形或卵圆形，细胞饱满，大小不规则;而经10 mmol/L阿司匹林处理后的K562细胞形态改变不明显.当阿司匹林的浓度达到20 mmol/L时细胞变小，变圆形，细胞崩解成许多碎片，细胞数目明显减少.尤其经过30 mmol/L阿司匹林处理的细胞悬浮脱落，可见较多死细胞(图1A).Hoechst 33258染色结果显示阿司匹林处理后的K562细胞核内可见致密的蓝色荧光，核固缩出现，并呈阿司匹林浓度依赖性(图1B).结果表明，阿司匹林促进K562细胞的凋亡.

图1 细胞形态学观察不同浓度阿司匹林对K562细胞的影响(A:光学显微镜下观察;B:Hoechst 33258染色观察)Fig.1 Effects of different concentrations of aspirin on the morphology of K562 cells(A:An optical microscopic observation;B:Hoechst 33258 staining observation)

2.2 阿司匹林对细胞增殖的影响

采用不同浓度的阿司匹林处理K562细胞，MTT法测定结果显示随着阿司匹林浓度的增大和作用时间的延长，K562细胞的存活数显著下降.阿司匹林处理24 h后细胞大多数凋亡，48 h后细胞基本都已死亡.与对照组相比，实验组的细胞增殖活性在24 h和48 h明显降低，具有显著统计学意义(P＜0.01)(图2A).

细胞计数法结果显示10 mmol/L阿司匹林处理24 h后细胞数目呈减少趋势，与0 mmol/L阿司匹林对照组相比细胞数目差异无统计学意义(P＞0.05);20和30 mmol/L阿司匹林处理24 h后细胞数目明显低于对照组(P＜0.05).阿司匹林处理48 h后K562细胞数目随着阿司匹林浓度的增大和作用时间的延长迅速下降(P＜0.01)(图2B).软琼脂克隆形成实验也发现随着阿司匹林浓度的增大K562细胞的克隆形成能力急剧下降.阿司匹林各浓度与对照组相比差异都很显著，有统计学意义(P＜0.05)(图2C).

图2 细胞增殖分析阿司匹林对K562细胞的影响A:MTT法检测不同浓度的阿司匹林处理K562细胞后的抑制曲线;B:细胞计数法检测不同浓度的阿司匹林处理K562细胞后的细胞数目变化;C:软琼脂克隆形成实验检测不同浓度的阿司匹林处理K562细胞后的克隆数，内置图是集落细胞的放大(*P＜0.05;＊＊P＜0.01).Fig.2 Effects of aspirin on the proliferation of K562 cellsA:MTT assays of K562 cells treated with different concentrations of aspirin.B:Cell counting assay of treated K562 cells.C:Soft agar colony formation assay of K562 cells treated with aspirin.The inset shows the amplification of colony cells.*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01.

2.3 阿司匹林对细胞凋亡的影响

K562细胞用阿司匹林处理36 h后以流式细胞仪进行分析，结果表明K562的晚期凋亡及凋亡后死亡数量随着阿司匹林浓度的增加而增加，而相应的存活细胞呈现明显的下降趋势.尤其K562细胞在30 mmol/L的阿司匹林作用下，早期凋亡细胞所占比例为(11.71±4.84)%，晚期凋亡和死亡细胞所占比例为(58.01±5.19)%.浓度为20 mmol/L和30 mmol/L的阿司匹林组与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05);而10 mmol/L的阿司匹林组与对照组相比无显著差异(P＞0.05)(表1).

表1 流式细胞仪检测阿司匹林对K562细胞凋亡的影响Tab.1 Effects of aspirin on K562 cell apoptosis detected by FACS

2.4 阿司匹林对裸鼠成瘤能力的影响

裸鼠体内实验观察可见，腹腔注射阿司匹林后裸鼠的肿瘤生长明显减慢，瘤组织上的血管较少，肿瘤的抑制率为37% ～42%(图3A).与生理盐水对照组相比肿瘤的质量和体积差异显著，有显著统计学意义(P＜0.01)(图3B-3D).这些结果提示阿司匹林对K562细胞株在裸鼠中的成瘤有明显的抑制作用.

2.5 细胞信号通道蛋白表达的影响

提取正常对照组和阿司匹林处理实验组细胞的总蛋白，进行Western印迹分析细胞信号通道蛋白的表达量变化.结果显示，以GAPDH蛋白表达量为内参，随着阿司匹林浓度的增加Wnt信号通道的关键因子βcatenin的蛋白表达量逐渐降低，而细胞周期抑制因子p21蛋白表达明显增高.同时信号传导与转录激活因子5A(STAT5A)的蛋白水平下降;细胞内DNA修复系统的重要成员多聚ADP核糖聚合酶(PARP)表达下调;核转录因子-κB p65基因的表达降低(图4).由此可见，阿司匹林可能影响Wnt、STAT、NF-κB信号通道和细胞周期的进程，进而抑制慢性粒细胞白血病细胞的生长和增殖.

图3 裸鼠成瘤实验(A:全身图;B:肿瘤图;C:肿瘤质量比较;D:肿瘤体积变化)Fig.3 Effect of aspirin on the in vivo tumorigenesis of K562 cells in nude mice(A:the whole-body images;B:the tumor image;C:the tumor weight measurement;D:the tumor volume measurement)

图4 阿司匹林对细胞信号通道蛋白的表达影响Fig.4 Effects of aspirin on the protein levels of cell signaling pathways

3 讨论

阿司匹林是医学史上的经典药物，也是应用最广泛的药物.近来发现阿司匹林可以降低癌症的发病风险和远处转移风险［5］.阿司匹林在体内外对多种体内致癌物诱发性和移植性肿瘤均有明显的抑制作用，而且腹腔注射阿司匹林对小鼠等均有显著抗肿瘤的作用［6-9］.血栓可促进癌细胞的转移，阿司匹林对抗肿瘤转移和扩散可能跟阿司匹林预防和破坏肿瘤细胞周围的血栓从而防止癌细胞转移有关［11］.因而阿司匹林是一种很好的肿瘤化学预防剂［12-13］.

白血病是起源于骨髓的恶性肿瘤，传统的化疗毒副作用大，易复发，高耐药性.作者的研究证实阿司匹林能够体外促进慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡性死亡，具有明显的细胞形态和细胞数目变化，而且存在浓度和作用时间的依赖性.采用Annexin V-FITC/PI标记流式细胞术检测发现30 mmol/L浓度的阿司匹林对K562细胞诱导凋亡作用最明显，细胞毒性作用最强.裸鼠成瘤实验也显示阿司匹林能有效抑制人K562裸鼠移植瘤的生长，实验组的肿瘤体积和质量明显低于对照组，抑瘤率为37% ～42%.本实验未发现有肿瘤转移，这可能与K562细胞在裸鼠中转移潜能低有关.阿司匹林能否抑制K562转移和扩散，需用不同的实验模型进行进一步的研究.总之，这些结果提示阿司匹林可能具有一定的治疗慢性粒细胞白血病的效果.

近年来的研究表明阿司匹林抗癌的机制有下调抑制凋亡bcl-2基因的活性，上调促进凋亡的bax基因表达，促进细胞凋亡［14］;抑制NF-κB活性导致细胞生长停滞［15］;抑制环氧合酶-2(COX-2)蛋白的表达从而抑制炎症和细胞分裂或降低前列腺素的合成而发挥抗肿瘤效应［16］;诱导自杀相关因子Fas表达，下调Fas配体(FasL)表达，通过 Fas-FasL途径诱导肿瘤细胞的免疫杀伤［17］.本实验提示阿司匹林降低了 β-catenin、STAT5A、PARP和NF-κB p65在K562细胞中的蛋白表达，而细胞周期抑制因子p21蛋白的表达增高.β-catenin是Wnt信号通道的关键蛋白，调节了癌细胞的增殖、分化和转移［18］.STAT通道持续激活可导致细胞异常增殖和恶性转化，目前发现STAT5A缺失可抑制癌细胞的存活率和延缓小鼠模型上乳腺癌的进展，提示降低STAT5A的活性可能是乳腺癌治疗的有效途径［19］.PARP主要在细胞过程如DNA修复和程序化细胞死亡中起作用，有研究表明PARP抑制剂引起DNA修复缺陷，这是肿瘤治疗的一类新药［20］.转录因子NF-κB p65与肿瘤转化、侵袭、转移、凋亡抵抗等密切相关，小干扰RNA沉默NF-κB p65基因表达可抑制胰腺癌细胞株PANC-1增殖并诱导其凋亡［21］.p21是一个抑癌基因，与细胞周期蛋白及其激酶复合物结合抑制Rb蛋白质的磷酸化而调节转录因子E2F的活性，从而阻止细胞周期从G1过渡到S期，抑制细胞增殖.并且p21的低表达与多数肿瘤的预后不良密切相关［22］.这些提示阿司匹林影响慢性粒细胞白血病中的Wnt、STAT、NF-κB信号通道和阻滞细胞周期进程，其具体作用机制及其细胞信号途径有待更深入的研究.由此可见，阿司匹林对慢性粒细胞白血病的治疗具有重要的应用和开发前景.

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