颗粒型环瓜氨酸肽抗原的制备及条件优化

付 琳，裘宇容，姜云飞，夏佳音，王海芳

（1．南方医科大学南方医院临床检验中心，广东 广州510515；2．广州市哈毕特实验仪器有限公司，广东 广州510730）

2010年美国风湿病学学会和欧洲风湿病学联盟联合制定了新的类风湿关节炎诊断分类标准［1］，抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP）被列入新的诊断标准中，成为诊断类风湿关节炎（RA）的新的血清学指标。目前，检测抗CCP抗体的方法主要有酶联免疫吸附测定法（ELISA）和化学发光分析法（CLIA）。ELISA法灵敏度较高，试剂成本较低，不需要昂贵的仪器设备，可在临床上广泛使用；但是，ELISA方法时间检测时间长，操作繁杂，不适合单个零散标本的检测，且需手工操作，检测线性范围窄，不易标准化。CLIA法检测高度敏感，特异性及重复性较好，检测范围宽，试剂稳定无毒害无污染，操作简单，检测过程耗时短，而且易于自动化以及单个样本的检测；但是CLIA法成本高收费贵，发光剂的发光性能难以稳定。为此开展一种新型的检测方法用于抗CCP抗体的检测，不仅可以缩短标本的检测时间，而且降低检测成本已成为CCP抗体检测的主要发展方向。研究开发一种新的试剂用于生化分析仪上检测，由于CCP多肽是小分子多肽，采用生化分析仪难以直接检测，因此必须将CCP与固相载体结合，增加其反应面积从而提高检测灵敏度。本研究即是探索颗粒型环瓜氨酸肽抗原的制备并对实验条件进化，为后续用于生化分析仪的测定奠定基础。

1 材料与方法

1．1 主要试剂和仪器

胶乳微球（粒径160nm），美国Bangslabs公司提供；瓜氨酸环肽，杭州中肽公司合成；牛血清白蛋白BSA、1－乙基碳酰二亚胺盐酸盐（EDC）、N－羟基琥珀酰亚胺（NHS），均为美国sigma公司生产；Bradford测蛋白试剂盒，南京凯基生物公司提供；其余所用化学试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

宁波新芝生物科技股份公司JY－92II型超声波细胞粉碎机；美国MD－SpectraMax M5多功能酶标仪。

1．2 实验方法

1．2．1 CCP多肽合成 由杭州中肽公司根据我们提供的氨基酸序列用Fmoc化学法合成，合成后经RP－HPLC纯化使浓度大于95%。根据杭州中肽公司提供合成样品的氨基酸序列分析资料、样品的HPLC分析图谱及样品的质谱图，证实合成物为CCP。

1．2．2 CCP与BSA偶联蛋白的制备 取BSA溶解于PH9．0碳酸盐缓冲液中，加入适量柠康酸酐，室温反应过夜。凝胶过滤除去多余的柠康酸酐。修饰后的BSA通过EDC反应与CCP偶联，通过对BSA与CCP偶联量、偶联pH及偶联时间进行优化，最终使CCP与BSA偶联产物蛋白大小在70－170kD之间，紫外吸收峰相对于BSA产生左移。然后在pH3．5的醋酸盐缓冲液中还原已被封闭的氨基，37℃反应2h，4℃透析过夜，浓缩干燥备用。

1．2．3 胶乳颗粒偶联方法 取0．1ml羧基化胶乳微球，加入0．9ml乙磺酸缓冲液（MES）混合均匀后加入EDC和NHS活化，室温条件下温和搅拌15 min。12 000g离心15min，用0．1mol／L磷酸缓冲液（PBS）重复清洗沉淀3遍，去上清，沉淀经0．1 mol／L PBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的胶乳微球。取2mg BSA－CCP溶于PBS，加入到1 ml经过活化的胶乳微球溶液中，室温条件下温和搅拌，达到反应时间后，12 000g离心15min，沉淀用含有0．05%Tween20的PBS重复清洗3遍，收集上清液，检测上清液中未反应的蛋白含量。

1．2．4 蛋白偶联量的测定

蛋白偶联量通过Bradford法检测反应前后溶液中的蛋白质含量变化求得：蛋白偶联量＝（加入蛋白总量—洗涤液中蛋白量）∕加入蛋白总量×100%，重复实验3次，取平均值得蛋白偶联的平均效率。

2 结果

2．1 CCP－BSA偶联产物蛋白

根据先前文献报道及蛋白特征，对BSA与CCP偶联条件进行筛选。BSA与CCP偶联质量比为1∶1，EDC与NHS用量比为2∶3，偶联PH为6．0，BSA与CCP偶联可以达到较好的效果。BSA与CCP偶联产物蛋白条带单纯BSA条带相比有明显差异。SDS－PAGE电泳图（图1）表明，BSA和CCP的偶联产物的电泳条带则出现在70KD－170KD之间不等。由于实验中无法控制CCP交联的数量，所以会产生不等条带的现象。紫外吸收光谱可以看出BSA在280nm处出现特征性吸收峰，BSA与CCP偶联产物蛋白的紫外吸收峰有明显左移，符合偶联蛋白的特征，如图2。

2．2 160nm羧基化胶乳微球偶联条件优化结果

2．2．1 EDC用量对偶联的影响

在相同条件下，取0．1ml微球（10mg干微球），加入pH6．0MES缓冲液中。取不同量的EDC以及NHS（EDC与NHS等量），混匀，室温反应15 min，洗涤，超声波重悬。取2mg BSA－CCP偶联产物蛋白，与活化微球混匀，室温反应2h，洗涤，检测上清液中蛋白含量。偶联结果如表1，EDC含量为0mg时，微球与偶联蛋白之间为物理吸附，吸附效率为19．67%。随着EDC用量由2．5mg／ml增加到10mg／ml，偶联蛋白的量也随之增加抗体的偶联效率由36．5%上升到63．66%，当EDC用量达到7．5mg／ml时，偶联蛋白效率达到63．66%，之后随着EDC用量的增加，偶联蛋白效率不再增加。EDC最佳用量为7．5mg／ml。

图1 BSA－CCP偶联产物SDS－PAGE电泳图

图2 BSA－CCP偶联抗原蛋白OD200－400扫描鉴定结果

表1 不同EDC用量对偶联效果的影响

2．2．2 偶联时间的优化

EDC用量和缓冲液pH恒定的条件下（EDC用量7．5mg／ml，pH7．5），分别在反应0h、0．5h、1h、2h、3h、4h测定蛋白偶联微球的效率。偶联时间对微球偶联效率的影响如图3所示，随着偶联时间的延长，蛋白偶联微球的效率不断增加，在偶联时间为0．5－2h内，偶联效率增加最快，当反应时间2h后，反应趋于平衡。因此，最佳的偶联时间为2－4h。

2．2．3 反应PH值的优化

采用水溶性碳二亚胺活化微球表面羧基，共价偶联制备的偶联产物蛋白，结果表明，缓冲液pH对偶联有较大的影响。用0．1mol／L磷酸盐缓冲液（PB），恒定其他反应条件不变（EDC用量为7．5 mg／mL，反应时间为2h）。反应前偶联蛋白含量均为2mg，调节缓冲液的pH 分别为6．0、6．5、7．0、7．5、8．0、8．5，进行蛋白偶联，在同样条件下，测定偶联前加入蛋白浓度和偶联后上清液的蛋白浓度，得到微球偶联蛋白量。由图4可见，pH为7．5时偶联效果最好，pH7．0－8．0为适宜偶联的pH范围。

3 讨论

有研究证明，关节滑膜组织中的瓜氨酸化蛋白在RA发生发展过程中起着重要的作用。这种有抗原驱动和T淋巴细胞介导的自身免疫反应被认为是RA发病的启动因子［2］。环瓜氨酸肽是21个氨基酸的多肽，其序列为其序列为HQCHQESTXGR SRGRCGRSGS，其中X代表瓜氨酸，其通过第3和第16位的半胱氨酸巯基氧化而形成环肽［3］。采用人工合成的CCP作为抗原检测抗CCP抗体的方法，已成为目前检测抗CCP抗体的主要方法。

聚苯乙烯微球是一种由苯乙烯聚合而成的高分子材料，表面带有功能基团，活化后可通过共价键结合蛋白质、酶、抗体、细胞等，已经广泛应用于免疫测定，亲和层次及临床诊断等领域［4，5］。包被有抗体／抗原的胶乳微球已被广泛应用于免疫诊断中，将不同的抗原／抗体连接在胶乳微球表面，通过免疫检测，可将一些常见疾病，如肝炎、流感等快速检测出来［6，7］。常用的制备胶乳－蛋白复合物的方法有两种：物理吸附法和共价偶联法。由于吸附会引起固定于胶乳微球表面蛋白的部分解吸及结构的变化，所以用物理吸附法制备的胶乳－蛋白复合物特异性低，在生物诊断中的应用受到限制。共价偶联法能在最大限度上控制吸附法中出现的问题，成为目前制备胶乳－蛋白复合物的主要方法。

本研究首先将CCP和一种无关蛋白（BSA）通过化学偶联方法共价偶联，后续采用BSA作为交联臂使CCP间接偶联到胶乳微球上，为后续建立检测抗CCP抗体方法奠定基础。采用的偶联载体是带有－COOH活性基团的聚苯乙烯微球。羧基化微球与蛋白质的偶联是氨基和羧基间的成酰胺键反应，在EDC以及NHS活化羧基与蛋白分子上的氨基之间进行。结果显示，EDC活化羧基与蛋白分子的氨基之间的反应受到多种因素的影响，如EDC用量、偶联时间、反应pH等。羧基化微球经过EDC和NHS活化形成较稳定的中间产物，该中间产物的很容易和氨基反应形成酰胺键，所以羧基活化是偶联反应的重要部分，羧基基团的活化直接影响蛋白偶联效率。而羧基活化多少与EDC用量有直接关系，EDC用量太少则不足以活化微球上的羧基，偶联效率较低；EDC用量过大则会使微球表面的羧基完全活化，蛋白偶联效率不会持续上升而是趋于平衡，造成不必要的浪费。若偶联时间过短，蛋白质则不能充分有效的和活化的微球反应；若偶联时间过长，蛋白偶联量达到饱和并且会出现一定程度的下降，而且长时间的反应可能会使蛋白分子在反应过程中氧化变性，蛋白偶联效率降低。另外，由NHS介导的EDC两步法偶联反应，EDC活化羧基与NHS形成较稳定活化酯中间产物，同蛋白分子上的氨基反应一般在pH7－8之间进行。过高或者过低pH条件下，蛋白分子容易变性失活，从而不利于后续研究的进行。

本研究通过间接方法将CCP抗原肽共价偶联到胶乳微球上。而偶联上的CCP抗原肽在一定条件下可以与抗CCP抗体特异性结合，因此可用于抗CCP抗体的检测。近年来，国内有不少研究微球和抗体偶联的报道［8，9］，报道微球与抗体的偶联效率一般在16．8%～60%。本研究结果探索了聚苯乙烯微球与自制的CCP抗原肽偶联蛋白的最佳偶联条件，可使蛋白偶联效率达到60%以上，为建立简便快速检测抗CCP抗体的方法奠定了良好的基础，应用前景广阔。

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