山东省苹果轮纹病菌对三种三唑类杀菌剂的敏感性检测

范 昆， 李晓军， 张 勇， 王 涛， 李 军， 曲健禄

（山东省果树研究所，泰安 271000）

苹果轮纹病（apple ring rot）是近年来苹果生产上危害最为严重的一种病害，不仅可以危害枝干，造成树势衰弱、枝干枯死，还能造成大量烂果，发病严重时田间病果率可高达70%～80%，且贮藏期可持续发病［1－2］。近年来山东省苹果种植区轮纹病发病率呈上升趋势，给果农带来严重的经济损失。

苹果轮纹病的病原菌为Botryosphaeriadothidea（Moug.ex Fr.）Ces.et de Not.，施用化学杀菌剂是目前防治苹果轮纹病的有效措施之一，常用药剂有多菌灵、甲基硫菌灵等内吸性药剂和代森锰锌、福美双等保护剂。由于生产上使用农药品种较为单一，苹果轮纹病菌已经产生了抗药性［3－4］。马志强，杨炜华等［5－6］检测了苹果轮纹病菌对多菌灵、甲基硫菌灵的抗药性，均发现中低水平抗性菌株。三唑类杀菌剂自1973年被引入后广泛用于各种病害的防治［7］，其中戊唑醇、苯醚甲环唑均已在苹果树病害防治中取得良好效果［8］，丙环唑正在田间推广应用于防治苹果轮纹病。本研究采用生长速率法，测定了山东省主要苹果产区14株苹果轮纹病菌对3种三唑类杀菌剂的敏感性差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株的采集和分离

2007年8－10月，分别于栖霞、蓬莱、沂源、泰安、阳信等地相距一定距离的果园内，随机采集轮纹病果，装入干净的小塑料袋中（每个袋子只装一个标本），带回实验室分离纯化获得14个苹果轮纹病菌株（Botryosphaeriadothidea）。

1.1.2 供试药剂

95.8%苯醚甲环唑（difenoconazole）原药，青岛瀚生生物科技股份公司；96.4%丙环唑（propiconazole）原药，青岛瀚生生物科技股份公司；98%戊唑醇（tebuconazole）原粉，江苏常隆化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含药培养基的配制

先将戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑原药溶于丙酮中，配成10 000 mg／L的母液，置4℃冰箱中备用，测定时，根据培养基的用量，用移液枪吸取一定量的药剂母液加入溶化并冷却至50℃左右的培养基中，充分摇匀，配成含戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑系列浓度的含药培养基。每处理重复4次，以不加药剂为对照。

1.2.2 苹果轮纹病菌对供试药剂的敏感性测定

在PDA平板上培养（26℃，黑暗）4 d的参试菌株菌落边缘打出直径7 mm的菌饼，分别移到含有戊唑醇、苯醚甲环唑、丙环唑6个梯度浓度（戊唑醇：1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.032μg／m L；苯醚甲环 唑：0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 6μg／m L；丙环唑：0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025μg／m L）的PDA平板上，置26℃暗培养4 d，测定菌落径向线性生长量，确定药剂对菌落生长的抑制率。每处理（每菌株每浓度水平）重复4次。

抑制生长率（%）＝［（对照菌落直径 －处理菌落直径）／（对照菌落直径 －菌饼直径）］×100。

1.3 数据处理

试验数据均由Microsoft Excel 2003、DPS数据处理工作平台进行统计分析。

通过菌丝生长抑制概率值和药剂浓度对数值之间的线性回归分析，求出各药剂对各供试苹果轮纹病菌菌株的有效抑制中浓度（EC50值）［9－10］，用 DPS对供试菌株EC50值的离差平方和进行系统聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同地理来源菌株对3种药剂的敏感性

苹果轮纹病菌对3种药剂的敏感性测定结果（表1）表明，苯醚甲环唑对14个菌株的EC50值在0.011 1～0.125 1μg／mL之间，平均值为（0.059 9±0.010 7）μg／mL，最高值约为最低值的11.27倍；丙环唑对14个菌株的EC50值在0.040 8～0.295 5μg／mL之间，平均值为（0.144 3±0.021 4）μg／mL，最高值约为最低值的7.24倍；戊唑醇对14个菌株的EC50值在0.086 8～0.578 3μg／mL之间，平均值为（0.217 2±0.037 7）μg／mL，其中菌株QX02的EC50值最大，TA01的EC50值最小，为最敏感菌株，前者的EC50值是后者的6.66倍。

表1 三种药剂对苹果轮纹病菌菌株的EC50值比较1）Table 1 The EC50 values of three fungicides against Botryosphaeria dothidea

续表1 Table 1（Continued）

采用Duncan氏新复极差法检验3种药剂对14个菌株EC50值的差异显著性。苯醚甲环唑对各菌株的EC50值除菌株PL01与QX01之间无显著差异外，其他菌株之间均存在极显著差异；丙环唑对各菌株的EC50值除菌株TA03与YY02之间无显著差异外，其他菌株之间均呈极显著差异；而戊唑醇对所有菌株的EC50值均存在极显著差异。

2.2 苹果轮纹病菌对3种药剂敏感性水平的系统聚类分析

2.2.1 供试菌株对苯醚甲环唑的敏感性水平

苯醚甲环唑对供试菌株EC50值的离差平方和系统聚类分析结果表明，14个菌株的EC50值由高到低可分为3个聚类组，第1组有5个菌株（YY03、PL02、QX03、TA02、PL03），第2组包括4个菌株（YY02、QX01、PL01、YX02），第3组包括5个菌株（YY01、TA03、QX02、YX01、TA01）。所有聚类组都包括不同的菌株系列，YY、QX系列内的3个菌株在3个聚类组中均有出现，PL、TA系列内的3个菌株出现在2个聚类组中，含两个菌株的YX系列分别出现在2个聚类组中（图1）。说明苹果轮纹病菌对苯醚甲环唑离体敏感性的差异和菌株的行政区域来源没有明显相关性，但同一地区不同菌株间的敏感性差异较大。

图1 苯醚甲环唑对苹果轮纹病菌EC50值的系统聚类分析Fig.1 Cluster analysis of the EC50 values of difenoconazole against B.dothidea

2.2.2 供试菌株对丙环唑的敏感性水平

统计分析结果表明，丙环唑对14个菌株的EC50值由高到低可分为3个聚类组，第1组仅1个菌株（QX03），第2组包括6个菌株（PL03、QX02、PL02、QX01、YY01、PL01），第3组包括7个菌株（YY03、YX02、TA03、YY02、TA02、TA01、YX01）。其中QX03自成一组，EC50值最大，敏感性水平最低，其他聚类组均包括不同的菌株系列，表明各供试苹果轮纹病菌对丙环唑的离体敏感性差异不明显。

图2 丙环唑对苹果轮纹病菌EC50值的系统聚类分析Fig.2 Cluster analysis of the EC50 values of propiconazole against B.dothidea

2.2.3 供试菌株对戊唑醇的敏感性水平

戊唑醇对苹果轮纹病菌EC50值的离差平方和系统聚类分析结果表明，14个菌株的EC50值由高到低分为3个聚类组，第1组3个菌株（QX02、YX02、YY02），第2组包括5个菌株（TA03、YY03、QX01、YY01、PL02），第3组包括6个菌株（TA02、YX01、PL03、QX03、PL01、TA01）。3个聚类组均包括不同的菌株系列，QX系列内的3个菌株在3个聚类组中均有出现，YY、PL、TA系列内的3个菌株出现在2个聚类组中，含两个菌株的YX系列分别出现在2个聚类组中（图3）。说明苹果轮纹病菌对戊唑醇离体敏感性的差异和菌株的行政区域来源没有明显相关性，但同一地区不同菌株间的敏感性差异较大。

图3 戊唑醇对苹果轮纹病菌EC50值的系统聚类分析Fig.3 Cluster analysis of the EC50 values of tebuconazole against B.dothidea

3 结论与讨论

本研究结果显示，各供试苹果轮纹病菌菌株对各药剂的敏感性均存在不同程度的差异。苯醚甲环唑、丙环唑和戊唑醇对山东省主要苹果种植区的14个菌株的EC50值分别在0.011 1～0.125 1μg／mL［平均值（0.059 9±0.010 7）μg／m L］、0.040 8～0.295 5μg／m L［平均值（0.144 3±0.021 4）μg／m L］、0.086 8～0.578 3μg／mL［平均值（0.217 2±0.037 7）μg／m L］之间。菌株YY03对苯醚甲环唑的敏感性较低，EC50是TA 01菌株EC50的11.27倍；菌株QX03对丙环唑的敏感性较低，EC50是YX01菌株EC50的7.24倍；菌株QX02对戊唑醇的敏感性较低，EC50是TA01菌株EC50的6.66倍。通过Duncan氏新复极差法和系统聚类分析结果表明，供试菌株之间对三唑类杀菌剂的敏感性差异较大。究其原因，其一可能与自然界病原菌本身的生理差异有关；其二，在苹果树生长期，三唑类药剂还被广泛应用于防治苹果斑点落叶病、苹果褐斑病等叶部病害，而各地使用的三唑类杀菌剂的种类和频率不尽相同，从而导致苹果轮纹病菌对这3种药剂的敏感性不同。

利用化学农药防治植物病害是植物病害综合防治措施之一，目前山东省各苹果主产区防治苹果轮纹病主要以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂为主，但因其高抗药风险性，病原菌极易产生抗性而使其防效降低［5］。国外对苯并咪唑类杀菌剂引起植物病原菌产生抗药性的报道很多［4，11－13］，在我国河北保定关于苹果轮纹病菌对多菌灵的抗药性也有相关报道［5］。三唑类杀菌剂是新一代高效、广谱、内吸、低毒杀菌剂，对谷物、果树、蔬菜及重要的经济作物由子囊菌、担子菌和半知菌引起的重要病害具有极好的治疗和铲除作用［14］。周增强［15］、苏平［8］等报道，戊唑醇对苹果轮纹病防治效果好且使用安全，本研究证明，三唑类杀菌剂对苹果轮纹病菌的抑制效果较好，表明该类药剂在苹果轮纹病防治中具有较大应用潜力。

本研究测定了苹果轮纹病菌在离体条件下对3种三唑类杀菌剂的敏感性水平，发现大部分菌株处在较高敏感水平，仅菌株TA01对苯醚甲环唑的敏感性较低，说明苹果轮纹病菌对三唑类杀菌剂存在一定的抗性风险，鉴于此，苹果轮纹病菌对3种药剂的抗性风险评价正在研究中。建议在推广中继续加强该菌的敏感性监测，通过合理使用药剂，防止或延缓病菌对三唑类杀菌剂产生抗性。

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