HPLC测定赤芝水提取物中灵芝酸A含量

卢端萍，陈硕，王勇，蒋婷婷

(1.福建省药品检验所，福建 福州 350001；2.福建省立医院，福建 福州 350001)

HPLC测定赤芝水提取物中灵芝酸A含量

卢端萍1*，陈硕1，王勇1，蒋婷婷2

(1.福建省药品检验所，福建 福州 350001；2.福建省立医院，福建 福州 350001)

目的：建立赤芝水提取物中灵芝酸A的含量测定方法。方法：采用C8柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，以乙腈-0.1%醋酸进行梯度洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长：256 nm，柱温：22 ℃。结果：样品中灵芝酸A分离较好，灵芝酸A的线性范围为15.32～306.4 μg·mL-1(r=1.000 0)，平均回收率为99.4%。结论：不同产地的赤芝水提取物中灵芝酸A含量有一定的差别，但该法简便、易行，为赤芝水提取物质量控制提供了参考依据。

高效液相；赤芝水提取物；灵芝酸A

灵芝为多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang的干燥子实体，具有补气安神、止咳平喘的功能。用于心神不宁，失眠心悸，肺虚咳喘，虚劳短气，不思饮食[1]。灵芝中主要含有多糖[2-5]、三萜[6-9]、核苷[10]、生物碱[11]、黄酮[7]、氨基酸及微量元素等多种化学成分，具有护肝、抗炎、抗高血压、抗肿瘤、降血脂、免疫调节[12]等功能。赤芝水提取物是灵芝类保健食品的主要原料之一，目前灵芝类产品质量控制大多用紫外分光光度法测定总三萜或粗多糖含量[13-14]，但紫外分光光度法专属性不强；有文献[15-16]报道采用核苷类成分作为灵芝类产品的质控指标，但真菌类药用植物中均有核苷类成分，因此核苷类成分也不适宜作为灵芝类保健食品的质控指标。三萜类成分作为灵芝的主要活性成分之一[17-19]，有必要对其含量进行测定，也有文献报道[20-25]采用高效液相色谱法测定灵芝子实体或灵芝孢子粉中灵芝三萜类成分的含量。作者以灵芝的主要功效成分——灵芝三萜中含量较高的灵芝酸A作为质控指标，建立了赤芝水提物中灵芝酸A的含量测定方法，为灵芝类保健食品的质量控制提供了参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪(岛津公司)，超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，超纯水器(赛多利斯)。

1.2 试药

灵芝酸A对照品(中国医学科学研究院药物研究所，纯度>98%)，赤芝水提取物D1～D10(福建仙芝楼生物科技有限公司在全国不同产地收集灵芝子实体后，采用相同的提取工艺，即水提、浓缩、干燥制得)。乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB C8(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；以乙腈为流动相A，0.1%醋酸为流动相B，按表1进行梯度洗脱，流速为1mL·min-1；检测波长为256 nm。柱温：22 ℃；进样量10 μL。理论板数按灵芝酸A计算应不低于5 000。在此色谱条件下，样品中灵芝酸A与其他组分分离效果较好，见图1。

表1 梯度洗脱程序

A.灵芝酸A对照品;B.赤芝水提取物样品；1.灵芝酸A图1 赤芝水提取物及对照品HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

取灵芝酸A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含灵芝酸A 90 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品0.2 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超声处理10 min，放冷，加甲醇定容至刻度，滤过，即得。

2.4 线性关系考察

精密称取灵芝酸A对照品适量，加甲醇分别制成浓度为15.32，30.64，61.28，153.2，306.4 μg·mL-1的溶液，分别吸取10 μL，注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件进行测定。以峰面积(mAU)为纵坐标，相应的对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=10.655X+1.55，r=1.000 0，表明灵芝酸A在15.32～306.4 μg·mL-1呈良好的线性关系。

2.5 重复性试验

取同一批号的赤芝水提取物(D1)样品6份，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，测得灵芝酸A平均含量为8.69 mg·g-1，RSD=0.35%，表明该法具有良好的重复性。

2.6 加样回收试验

取已知含量的同一批号赤芝水提取物(D1)样品，采用加样回收试验，精密加一定量灵芝酸A对照品，按供试品溶液的制备方法和色谱条件测定，并计算回收率，结果见表2。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液分别于0，2，4，8，16，24 h进样，按上述色谱条件测定灵芝酸A含量，结果RSD=0.67%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

表2 灵芝酸A回收率试验

注：灵芝酸A对照品加入量均为0.924 0 mg

2.8 样品测定

对10批赤芝水提取物样品按上述含量测定方法进行测定，结果见表3。

表3 赤芝水提物10批样品含量测定结果 /mg·g-1

3 讨论

3.1 流动相的选择

实验曾采用乙腈-水梯度洗脱，结果分离效果较差，灵芝酸A对照品峰形很差，后采用乙腈-2%醋酸[17]梯度洗脱，结果灵芝酸A色谱峰中含有一较小的杂质峰，导致回收率偏低，经调节流动相不同比例，分离效果仍不理想，后采用本文流动相梯度洗脱程序，考察了不同浓度的醋酸(0.1%，0.5%，1%，2%)，结果显示醋酸浓度对分离结果影响较大，随着醋酸浓度增大，灵芝酸A与杂质峰分离越差，本实验流动相中醋酸浓度定为0.1%。

3.2 柱温选择

本实验曾考察不同柱温(22，25，30 ℃)分离效果影响，结果表明柱温对分离效果影响很大，柱温为30 ℃时，灵芝酸A与杂质峰分离不开，柱温25 ℃时，分离效果有所改善，当柱温设为22℃时，灵芝酸A与前后杂质峰均能较好地分离。

3.3 提取溶剂的选择

曾考察甲醇和三氯甲烷两种提取溶剂，以甲醇为提取溶剂，灵芝酸A含量较高；以三氯甲烷作为提取溶剂时，杂质较少，但回收率偏高，故本实验采用甲醇为提取溶剂。

3.4 提取时间的选择

曾对其提取时间进行考察(10，15，20，25 min)，结果超声提取10 min，样品中灵芝酸A已提取完全。

从以上测定结果可以看出，不同产地的赤芝水提取物中灵芝酸A含量有一定差别，可能系灵芝不同培养基质、生长环境、采收季节等因素影响所致。

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DeterminationofGanodericAcidAinGanodermalucidumWaterExtractsbyHPLC

LU Duan-ping*，CHEN Shuo，WANG Yong，JIANG Ting-ting

(1.FujianInstituteforDrugControl，Fuzhou350001，China； 2.FujianProvincialHospital，Fuzhou350001，China)

Objective：To establish a method for determination of ganoderic acid A inGanodermasinensis water extracts by using high performance liquid chromatograph with Diode array detector.Methods：A C8column(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)was used，the mobile phase consisted of acetonetrile-0.1% acetic acid by gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 256 nm and column temperature was maintained at 22 ℃.Results：The calibration curves of ganoderic acid A was linear in the range of 15.32～306.4 μg·mL-1(r=1.000 0).The average recovery was 99.4%.Conclusion：There is some difference in ganoderic acid A content of different originGanodermalucidumwater extracts，but this method is simple and reliable for quality control ofGanodermalucidumwater extracts.

Ganodermalucidumwater extracts； HPLC； Ganoderic acid A

2012-10-11)

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卢端萍，Tel:(0591)87622209，E-mail：ldp18@tom.com