氧化低密度脂蛋白对血管内皮细胞黏附分子表达的影响

何玉萍，江 湧，何玉珊，许翌嘉

动脉硬化（AS）是动脉血管壁的一种慢性炎症性疾病［1］，细胞黏附分子（CAMs）是介导细胞与细胞之间、细胞与细胞基质之间相互黏附的糖蛋白，正常情况下呈低水平表达，在炎性反应刺激下表达明显上调。研究表明，AS处内皮细胞分泌的黏附分子增加，炎性基因的表达也增加［2］。本实验采用单核细胞－内皮细胞（MC－EC）联合培养的方法，观察氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）对人脐静脉内皮细胞（ECV304）CAMs表达的影响，探讨ox－LDL损伤血管内皮细胞（VEC）的作用及机制。

1 材料与方法

1．1 材料 ECV304细胞株（中山大学细胞库），人类单核细胞系U937（上海细胞生物研究所）；RPMI－1640培养液（美国GIBCO）；胎牛血清（美国 GIBCO）；低密度脂蛋白（LDL，美国SIGMA）；单克隆抗体CD106－FITC、CD54－PE、CD62E－PE、CD62P－PE、IgG－PE、IgG－FITC（均是美国PharMingen产品）；流式细胞仪：（美国BECKMAN COULTE公司 ALTRA型），四色荧光，配套EXPO 32采集分析软件。

1．2 ox－LDL的制备 将LDL置于含10μmol／L CuSO4的PBS（pH7．2）溶液中，37℃温育24h，再将ox－LDL液置含200 μmol／L EDTA的PBS 4℃中透析24h，超滤除菌后4℃保存备用。

1．3 实验方法

1．3．1 MTT法检测不同浓度ox－LDL对细胞活性的影响细胞以5×104个／mL细胞数接种入96孔培养板，待细胞生长至稳定状态（约24h），分别加入ox－LDL高浓度组（100μg／mL）、中浓度组（50μg／mL）、低浓度组（25μg／mL），正常对照组加等量生理盐水，置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱培养24h后，每孔加入10g／L的 MTT 10μL，培养4h，弃去培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），置微量振荡器上振荡10 min，酶标仪（波长570nm）测定吸光值（OD），筛选ox－LDL适宜作用浓度。

1．3．2 ox－LDL对血管内皮细胞黏附分子表达的影响 将ECV304细胞接种于24孔板，待细胞生长至稳定状态（约24 h），加入50μg／mL ox－LDL，对照组加等量生理盐水，置于37℃、5%CO2、95%空气的培养箱中培养，24h后，移去培养液，每孔加入含4×104人类单核细胞系U937细胞培养基细胞悬液，37℃孵育30min，移去培养液，用PBS轻洗2遍，去除未黏附的细胞，用0．25%胰蛋白酶和0．02%EDTA混合液消化收集细胞，测定细胞间黏附分子－1（ICAM－1，CD54）、血管细胞黏附分子－1（VCAM－1，CD106）、E－选择素（CD62E）和P－选择素（CD62P）。

1．4 FCM检测 VCAM－1、ICAM－1、CD62E、CD62P的表达率 收集上述单细胞悬液，PBS洗两次，分别加入CD106－FITC、CD54－PE、CD62E－PE、CD62P－PE单克隆抗体各10 μL，室温避光孵育30min后，PBS洗2遍，流式细胞仪检测，其结果以阳性百分率表示。每份样本均设阴性对照（加相应IgG抗体），以消除本底荧光的影响。

1．5 统计学处理 用SPSS16．0软件进行t检验，数据以均数±标准差（±s）表示。

2 结 果

2．1 MTT检测结果 ox－LDL作用的各组细胞活性均下降，与正常组比较，高、中浓度组有统计意义（P＜0．05），而低浓度组无统计意义，提示50μg／mL ox－LDL为适宜的作用浓度。详见表1。

表1 ox－LDL不同浓度作用对内皮细胞ECV304活性的影响（±s）

表1 ox－LDL不同浓度作用对内皮细胞ECV304活性的影响（±s）

与正常组比较，1）P＜0．05

组别 n MTT（OD值）正常组10 0．771±0．062低浓度组 10 0．699±0．067中浓度组 10 0．624±0．0301）高浓度组 10 0．589±0．0551）

2．2 ox－LDL对血管内皮细胞黏附分子表达的影响 ox－LDL作用损伤组细胞表面黏附分子VCAM－1、ICAM－1、CD62E、CD 62P表达率均明显增高，与正常组比较有统计学意义（P＜0．01）。详见表2。

表2 ox－LDL对ECV304细胞黏附分子表达的影响（±s） %

表2 ox－LDL对ECV304细胞黏附分子表达的影响（±s） %

与正常组比较，1）P＜0．05

组别 n VCAM－1 ICAM－1 CD62E CD62P正常组 10 3．66±1．19 50．82±6．62 12．27±1．43 5．54±0．76 ox－LDL损伤组 30 9．77±2．461） 77．62±3．181） 23．59±2．841） 18．96±2．171）

3 讨 论

AS是危害人类健康最大的疾病之一，是心脑血管病的主要病理基础，其发病机制复杂，尚未完全阐明。自Ross提出AS发病机制的“损伤反应”学说至今，VCE损伤在AS的形成与发展中的地位日趋受到关注。在AS解剖学证据出现之前已有内皮功能紊乱的表现［3，4］，而VEC功能紊乱是AS发病的早期关键性环节［5］。

ox－LDL是AS明确的危险因子，动脉壁中ox－LDL的存在是造成动脉壁持续损伤重要因素之一，ox－LDL可直接损伤内皮细胞，通过信号传导通路改变内皮细胞分泌活性，介导单核细胞对内皮细胞的黏附，导致内皮细胞的损伤［6，7］。人AS的斑块中有ICAM－1的表达，并在AS的病理过程中起重要作用［8］。高血脂患者血中的可溶性的ICAM－1、VCAM－1均升高，认为血中可溶性ICAM－1、VCAM－1是反应动脉粥样硬化的早期变化指标［9］。MC－EC黏附是内皮细胞功能受损而处于激活状态的表现之一，两种细胞黏附不仅是物理接触，而且涉及MC、EC细胞表面诸多分子之间的相互作用，在相互作用过程中两种细胞的功能均发生相应变化，促进细胞CAMs表达，而CAMs介导的炎症细胞与血管内皮细胞的黏附及损伤作用，被认为是AS重要的始动环节，可作为炎症活动的指标［2，10］。本实验采用对 U937－ ECV304联合培养的方法，用ox－LDL为诱导损伤因素，FCM进行分析ECV304细胞表面VCAM－1、ICAM－1、E－选择素、P－选择素的表达，探讨ox－LDL致VEC损伤机制；结果显示，ox－LDL促使内皮细胞CAMs表达明显上调，提示ox－LDL在内皮细胞黏附分子合成或诱导过程中扮演了较为重要的角色，ox－LDL刺激诱导内皮细胞CAMs表达增高，而CAMs的高表达，又促进单核细胞黏附于内皮细胞，影响血管内皮细胞功能，参与AS化的形成和发展。

VEC是多种危险因子作用的重要靶器官。Ox－LDL通过介导单核细胞和血管内皮细胞黏附，上调血管内皮细胞CAMs的表达，致内皮细胞功能紊乱，损伤VEC。阻断或抑制ox－LD对内皮细胞功能的损害，能有效预防、治疗心血管疾病的发生、发展。

［1］ Andersson J，Libby P，Hansson GK．Adaptive immunity and atherosclerosis［J］．Clin Immunol，2010，134（1）：33－46．

［2］ Dai G，Kaazempur－Mofrad MR，Natarajan S，et al．Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis－susceptible and resistant regions of human vasculature［J］．PNAS，2004，101（41）：14871－14876．

［3］ 郭渝成，张为，陈莉，等．微血栓形成与内皮细胞损伤间关系的临床及实验研究［J］．中国微循环，2002（3）：141－143．

［4］ Quinones MJ，Nicholas SB，Lyon CJ．Insulin resistance and the endothelium［J］．Curr Diab Rep，2005，5（4）：246－253．

［5］ Falk E．Pathogenesis of atherosclerosis［J］．J Am Coll Cardiol，2006，47（8Suppl）：7－12．

［6］ Vannini N，Pfeffer U，Lorusso G，et al．Endothelial cell aging and apoptosis in prevention and disease：E－selectin expression and modulation as a model［J］．Curr Pharm Des，2008，14（3）：221－225．

［7］ Akahashi H，Hara K．Cardiovascular diseases and oxidative stress［J］．Rinsho Byori，2003，51（2）：133－139．

［8］ Hajilooi M，Sanati A，Ahmadieh A，et al．Circulating ICAM－1，VCAM－1，E－selectin，P－selectin，and TNF－αⅡin patients with coronary artery disease［J］．Immunol Invest，2003，32（4）：245－257．

［9］ Mansoor MA，Seljeflot I，Arnese N，et al．Endothelial cell adhesion molecules in healthy adults during acute hyperhomocysteinemia and mild hypertriglyceridemia［J］．Clin Biochem，2004，37（5）：408－414．

［10］ 蔡强军．单核－内皮细胞相互作用与动脉粥样硬化研究进展［J］．中国动脉硬化杂志，2002，10（1）：83－85．