L-苹果酸对湘云鲫生长性能、体组成、消化和抗氧化能力的影响

敬 婷 罗 莉 白富瑾 钱 前 孙玉轩 石亚庆 李 赞

(西南大学动物科技学院，淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，水产科学重庆市市级重点实验室，重庆 400715)

L-苹果酸是生物体代谢过程中产生的重要有机酸，是三羧酸循环(TCA)的中间代谢产物，可直接参与线粒体能量代谢［1］。同时，它又是苹果酸-天冬氨酸穿梭的组成部分，对胞液和线粒体之间还原当量的转移起着重要的作用［2］。L-苹果酸在饲料添加剂方面的研究主要集中在反刍动物上，它可作为酸味剂提高饲料的适口性，降低饲料的pH，促进小肠的消化吸收，也可作为能量物质直接被机体使用［3］。杨威等［4］报道反刍动物饲喂苹果酸可以提高饲料的转化率，提高动物的生长性能。而L-苹果酸在水产动物中的研究仅见Hossain 等［5］对真鲷(sea bream)的研究，研究发现饲料中添加1%苹果酸对生长性能无显著影响，但是可以增加磷的利用率，以及Michael等［6］对吉富罗非鱼的研究，研究认为饲料中添加0.01 mol/L苹果酸并不能刺激进食行为。而相近的研究则表明酸化剂能够促进罗非鱼［7］、草鱼［8］、鲤鱼［9］、湘云鲫［10］和虹鳟［11］等鱼类的生长。本试验以湘云鲫为研究对象，拟探讨L-苹果酸对其生长性能、体组成、消化和抗氧化能力的影响，并确定L-苹果酸在其饲料中的适宜添加量，以期为湘云鲫饲料生产中合理应用苹果酸提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

根据湘云鲫的营养需求，以秘鲁鱼粉、大豆粕(去皮膨化)、棉籽粕、菜籽粕等为主要原料配制基础饲料，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加 0(对照)、1、2、4、8 和 16 g/kg 的 L-苹果酸(购自Sigma公司)，配制成6种试验饲料。各试验饲料制成粒径为2.0 mm的颗粒饲料，60℃烘干后，置-20℃冰箱保存备用。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 试验鱼与饲养管理

试验用鱼为湘云鲫，购自重庆大足渔场。试验鱼先经浓度3%的食盐溶液消毒后，暂养于水族缸中，以基础饲料驯化10 d。正式试验开始前，选择健康、均重为(16.25±0.03)g湘云鲫450尾，随机分为6组，每组3个重复，每个重复25尾鱼。养殖容器为180 L玻璃水族缸，水源为曝气后的自来水，每天按体重的2% ～3%分4次投喂(08:00、11:00、14:00、17:00)，手动小心投饲直至鱼不再摄食为止。每天18:00换水1次，换水量为100%，以保证水质清新。试验期90 d，试验期间水温22～30℃，pH 6.6～7.0，溶氧浓度大于5 mg/L，氨氮浓度小于0.05 mg/L。

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 饲料pH和系酸力的测定

饲料pH采用Radecki等［12］推荐的方法:称取20 g饲料放入烧杯中，分别加入40、60、80 mL去离子水，用玻璃棒稍用力搅拌至呈浆状液后，用pHS-25(数显)pH计测定不同稀释率下的pH。饲料系酸力采用Bolduna等［13］推荐的方法测定:称取100 g风干饲料(全部通过60目标准筛)放入烧杯中，加入200 mL去离子水，在恒温水浴锅中加热至37℃左右，取下放在磁力搅拌器上搅拌并插入温度计，将温度控制在(37±1)℃。将pH计电极插入溶液中，用1 mol/L的盐酸逐步进行滴定至pH=4.0时所用盐酸的毫升数即为该饲料的系酸力。

1.3.2 生长性能指标的测定

试验结束时试验鱼饥饿24 h后准确称鱼体和饲料重，测定其摄食量(feed intake，FI)、增重率(weight gain rate，WGR)和饲料系数(feed conversion ratio，FCR)，计算公式如下:

1.3.3 全鱼体组成和饲料营养成分沉积率的测定

试验前取5尾鱼作为初始样本，试验结束后每重复随机取5尾作为终末样本，根据《饲料标准资料汇编》中的方法测定鱼体以及饲料中水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分的含量，再计算饲料的蛋白质沉积率(protein retention ratio，PRR)、脂肪沉积率(lipid retention ratio，LRR)和灰分沉积率(ash retention ratio，ARR)，计算公式如下:

1.3.4 消化和抗氧化指标的测定

养殖试验结束称重后，每组随机取15尾鱼，在冰盘中解剖，取出肠道和肝脏(剥除多余的脂肪和结缔组织)，用生理盐水(4℃)冲净消化道内容物，并用滤纸吸干水分后称重，称重后剪碎混匀，按1∶9(质量体积比，g/mL)加入生理盐水(4℃)，迅速转入玻璃匀浆器匀浆(匀浆过程在冰浴环境中进行)，然后将匀浆液离心(4℃，3 500 r/min)10 min，取上清液制得粗酶液。将粗酶液置于-80℃超低温冰箱中冷藏保存，用于肠道和肝脏各指标的测定。

肠道消化酶(淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶)和Na+/K+-ATP酶活性以及肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、苹果酸脱氢酶(MDH)活性与丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。淀粉酶活性单位定义为:在37℃条件下，每毫克组织蛋白质与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个酶活性单位。脂肪酶活性单位定义为:在37℃条件下，每克组织蛋白质在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1μmol底物为1个酶活性单位。胰蛋白酶活性单位定义为:在pH 8.0、37℃条件下，每毫克组织蛋白质中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003即为1个酶活性单位。Na+/K+-ATP酶活性单位定义为:每小时每毫克组织蛋白质中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为1个酶活性单位。组织中蛋白质含量以牛血清蛋白为标准，用考马斯亮蓝法测定。

1.4 数据处理与计算公式

采用SPSS 17.0统计软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，同时采样Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05为差异显著。所有数据均以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 L-苹果酸对饲料p H和系酸力的影响

由表2可知，饲料中添加L-苹果酸对饲料pH和系酸力有显著影响(P＜0.05)。随着L-苹果酸添加水平的提高，饲料pH和系酸力显著下降(P＜0.05)，即饲料的酸度逐渐增高，在16.0 g/kg组达到最高。

表2 L-苹果酸对饲料pH和系酸力的影响Table 2 Effects of L-malic acid on pH and acid-binding capacity of diets

2.2 L-苹果酸对湘云鲫生长性能的影响

由表3可知，饲料中添加L-苹果酸后湘云鲫的终末尾均重、增重率、摄食量均有所增加，而饲料系数则有所下降。其中，以4.0 g/kg组的生长效果最佳，与对照组相比，其增重率、摄食量分别提高了27.17%、26.77%(P＜0.05)，饲料系数则降低了16.40%(P＜0.05)。

表3 L-苹果酸对湘云鲫生长性能的影响Table 3 Effects of L-malic acid on growth performance of triploid crucian carp(Carassius auratus)

2.3 L-苹果酸对湘云鲫体组成及饲料营养成分沉积率的影响

2.3.1 L-苹果酸对湘云鲫体组成的影响

由表4可知，饲料中L-苹果酸添加水平为0～8 g/kg时，全鱼水分含量逐渐下降，粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量逐渐增加。与对照组相比，8 g/kg组全鱼水分含量降低了2.73%(P＜0.05)，而粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量分别增加了 4.60%、13.20%和13.03%(P＜0.05);4 g/kg组全鱼水分含量降低了2.52%(P＜0.05)，而粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量分别增加了2.58%、10.53%和10.92%(P＜0.05);4、8 g/kg组之间上述指标差异不显著(P＞0.05)。

表4 L-苹果酸对湘云鲫体组成的影响(鲜重基础)Table 4 Effects of L-malic acid on body composition of triploid crucian carp(Carassius auratus)(fresh weight basis) %

2.3.2 L-苹果酸对湘云鲫饲料营养成分沉积率的影响

由表5可知，各L-苹果酸添加组的蛋白质、脂肪和灰分沉积率均较对照组显著提高(P＜0.05)。其中，蛋白质和脂肪沉积率均在4 g/kg组达到最大值，分别较对照组提高了32.13%和39.97%(P＜0.05);灰分沉积率在8 g/kg组达到最大值，较对照组提高了49.91%(P＜0.05)。

2.4 L-苹果酸对湘云鲫肠道消化酶活性和Na+/K+-ATP酶活性的影响

由表6可见，随着饲料中L-苹果酸添加水平的增加，肠道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和Na+/K+-ATP酶活性均呈先升高后降低的趋势，且均在8 g/kg组达到最大值，分别较对照组提高了31.46%、96.98%、12.00% 和 42.30%(P＜0.05)。16 g/kg组(高添加水平组)的肠道淀粉酶和脂肪酶活性虽然比对照组显著增加(P＜0.05)，但其胰蛋白酶和Na+/K+-ATP酶活性则均显著低于对照组(P＜0.05)，分别比对照组降低了27.90%和49.30%。

表5 L-苹果酸对湘云鲫饲料营养成分沉积率的影响Table 5 Effects of L-malic acid on dietary nutrient retention ratio of triploid crucian carp(Carassius auratus) %

表6 L-苹果酸对湘云鲫肠道消化酶和Na+/K+-ATP酶活性的影响Table 6 Effects of L-malic acid on intestinal digestive enzyme and Na+/K+-ATPase activities of triploid crucian carp(Carassius auratus)

2.5 L-苹果酸对湘云鲫肝脏SOD、MDH活性及MDA含量的影响

由表7可知，随着饲料中L-苹果酸添加水平的增加，肝脏SOD和MDH活性呈先升高后降低趋势，而MDA含量则相反。在4.0 g/kg组，肝脏SOD和MDH活性达到最大值，MDA含量达到最小值，并均与对照组差异显著(P＜0.05);在16.0 g/kg组，肝脏SOD和MDH活性较对照组降低了12.28%和46.15%(P＜0.05)，MDA含量增加了15.42%(P＜0.05)。

表7 L-苹果酸对湘云鲫肝脏SOD、MDH活性及MDA含量的影响Table 7 Effects of L-malic acid on liver SOD and MDH activities and MDA content of triploid crucian carp(Carassius auratus)

3 讨论

酸化剂对鱼类生长的影响受多种因素影响，其中酸化剂的类型和添加量、鱼的种类、饲料的营养水平与系酸力等是较为主要的因素。据报道，在饲料中添加2、3 g/kg的柠檬酸后鲤鱼、罗非鱼增重率分别提高了 12.3%［9］、12.5%［15］;柠檬酸还可促进草鱼［8］、虹鳟［11］、中国对虾［16］和异育银鲫［17］的生长;乳酸和磷酸对罗非鱼也有一定的促生长作用［18］;但在革胡子鲶饲料中添加柠檬酸并无明显促生长作用［19］。本研究以湘云鲫为研究对象，添加1～16 g/kg的L-苹果酸，结果显示，饲料中添加L-苹果酸后，湘云鲫的生长和对饲料的利用效果都得到提高，其中4 g/kg组生长效果最佳，这与潘庆等［20］在罗非鱼饲料中添加1～4 g/kg的柠檬酸得到的结果相似。

苹果酸的促生长机制与其可降低饲料和消化道pH，提高消化酶活性有关。对无胃鱼而言，酸性食糜可刺激十二指肠和胰脏分泌更多的消化液以中和其中的酸，以此为肠道中消化酶提供适宜pH环境［21］。饲料系酸力可反映饲料结合酸的能力，系酸力越高的饲料，酸结合能力越强，在消化道内结合的游离酸就越多，导致消化道内pH升高越多，破坏鱼类适宜消化吸收的酸性环境。大量研究结果表明，降低饲料系酸力能有效提高畜禽饲料采食量，促进生长发育，并大幅提高日增重和饲料转化率［22-24］。本试验结果表明，在湘云鲫饲料中添加适量L-苹果酸后，饲料系酸力降低，湘云鲫摄食量和增重率增加，这与上述研究结果相一致。目前苹果酸对鱼类消化酶活性影响的研究尚未见报道，相近的研究表明，罗非鱼饲料中添加1～4 g/kg的柠檬酸，饲料pH呈下降趋势，胃蛋白酶、肝胰脏蛋白酶、肠道淀粉酶活性呈先上升后下降趋势［20］;王纪亭等［21］报道，在鲤鱼饲料中添加0.3%的复合酸，显著提高了肝胰脏、肠道蛋白酶活性，淀粉酶、脂肪酶活性有升高的趋势，但与对照组差异不显著。在本试验中，饲料中添加L-苹果酸后，湘云鲫肠道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶以及Na+/K+-ATP酶的活性均不同程度升高，并均在8 g/kg组达到最大值。而当添加水平达到16 g/kg时，除脂肪酶外的肠道其他各酶活性均显著降低，这与16 g/kg组增重率及饲料效率低于适宜添加组的结果相一致。上述结果说明，饲料中适量添加酸化剂有利于刺激肠壁消化腺的代谢分泌活动，增加消化酶的分泌量，提高消化酶活性，促进消化吸收，从而促进生长;添加过量的酸化剂则可能对消化道表面造成损伤，使鱼类处于应激状态［25］，生长促进作用显著降低。

前人关于酸化剂对鱼类体组成影响的研究表明，罗非鱼饲料中添加 1% ～4%柠檬酸［11］或0.3%的磷酸、富马酸、乳酸［10］，草鱼饲料中添加0.21%的磷酸、柠檬酸、乳酸、复合酸［8］均对鱼体组成无显著影响。但在本试验中，饲料中添加L-苹果酸后，湘云鲫鱼体水分含量下降，粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量增加，且饲料蛋白质、脂肪和灰分沉积率均显著增加，以饲料灰分和脂肪沉积率的增高最为明显，这可能与苹果酸提高矿物质的利用［8］和提高肝脏MDH活性有关，MDH活性越高，机体产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)越多，从而促进了脂肪的沉积。

动物机体抗氧化能力是衡量机体健康状态的重要指标之一，SOD是一类特异性消除超氧自由基的循环酶，主要负责过氧化和嗜菌作用造成的组织损伤的防御保护作用［26］。机体中MDA的含量反映的是机体脂质过氧化的程度，从而反映出细胞损伤程度［27］。尚卫敏等［8］在饲料中添加4种不同类型酸化剂后发现，4种酸化剂均可显著提高草鱼机体的抗氧化能力;张纯等［28］研究发现，饲料中添加200～400 mg/kg绿原酸能显著增强建鲤的抗氧化能力;吴军林等［29］发现，L-苹果酸能够显著改善老年大鼠机体代谢酶的代谢能力，有利于增强肝组织新陈代谢和抗氧化能力。本试验中，饲料中适量添加L-苹果酸可显著提高湘云鲫肝脏中SOD的活性并同时显著降低MDA的含量，说明L-苹果酸可提高湘云鲫机体抗氧化能力。其原因可能是L-苹果酸能使机体保持还原状态，为抗氧化酶的还原和再生提供有利的条件，促进机体的能量代谢速率，为大分子蛋白质的合成提供能量基础。

4 结论

①饲料中适量添加L-苹果酸能够促进湘云鲫生长，降低饲料系数，增加鱼体营养物质沉积，提高消化和抗氧化能力。

②湘云鲫饲料中L-苹果酸的适宜添加量为4～8 g/kg。

［1］刘建军，姜鲁燕，赵祥颖，等.L-苹果酸的应用及研究进展［J］.中国食品添加剂，2003(3):53-56.

［2］邱俊强.苹果酸低聚糖饮料抗运动性疲劳的代谢机制研究［D］.博士学位论文.北京:北京体育大学，2002.

［3］李赞，罗莉，陈任孝，等.苹果酸在反刍动物中的应用［J］.中国饲料，2012(11):30-33.

［4］杨威，刁其玉，李辉.苹果酸在反刍动物饲料中的应用［J］.饲料工业，2006，27(13):47-48.

［5］HOSSAIN M A，PANDEY A，SATOH S.Effects of organic acids on growth and phosphorus utilization in red sea bream Pagrus major［J］.Fisheries Science，2007，73(6):1309-1317.

［6］ADAMS M A，JOHNSEN PB，ZHOU H Q.Chemical enhancement of feeding for the herbivorous fish Tilapia zillii［J］.Aquaculture，1988，72(1/2):95-107.

［7］李海涛，胡云华，王银东，等.酸化剂对奥尼罗非鱼生长性能和饲料利用的影响［J］.南方水产，2009，5(5):67-71.

［8］尚卫敏，朱根廷，陈任孝，等.酸化剂对草鱼生长和非特异性免疫能力的影响［J］.淡水渔业，2011，41(5):56-61.

［9］夏长青，刘豫宁，符冬岩，等.饲料中添加柠檬酸促进鲤鱼生长的试验［J］.上海水产大学学报，1998，7(增刊1):406-408.

［10］向枭，周兴华，陈建，等.乳酸对鲫鱼的生长及饲料利用率的影响［J］.中国饲料，2009(11):40-41.

［11］BALAMURALI R S，ARAVINDAN C M.Citric acid as a feed stimulant［J］.Fishery Technology Society of Fisheries Technologists India，1997，34(1):9-12.

［12］RADECKI S V，JUHL M R，MILLER E R.Fumaric and citric acids as feed additives in starter pig diets:effect on performance and nutrient balance［J］.Journal of Animal Science，1988，66(10):2598-2605.

［13］BOLDUNA G H，JUNG R，SCHNEIDER J.Influence of fumaric acid and propanediol formate on piglets［J］.Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition，1988，59(3):143-149.

［14］汪福保，罗莉，李云，等.镁对草鱼生长和脂肪代谢的影响［J］.动物营养学报，2010，22(1):93-99.

［15］冷向军，钟炜，黄春萍，等.饲料中添加柠檬酸对罗非鱼的养殖效果分析［J］.广西农业生物科学，2001，20(4):262-265.

［16］范九国.配饵添加柠檬酸养虾试验［J］.齐鲁渔业，1993(1):33-34.

［17］冷向军，伦峰，李小勤，等.柠檬酸对异育银鲫生长及营养物质消化率的影响［J］.上海水产大学学报，2006，15(2):178-181.

［18］潘庆，谭永刚，毕英佐，等.酸制剂对罗非鱼生长和饲料利用的影响［J］.水产学报，2004，28(6):682-688.

［19］戴振炎，刘淑逑，肖调义.添加麦饭石和柠檬酸投喂革胡子鲶的试验研究［J］.内陆水产，1997(3):4-6.

［20］潘庆，谭永刚，毕英佐，等.柠檬酸对罗非鱼生长、体成分和消化酶活性的影响［J］.中国水产科学，2004，11(4):344-348.

［21］王纪亭，李海涛，宋憬愚，等.复合酸化剂对鲤生长及消化酶活性的影响［J］.广东海洋大学学报，2009，29(1):21-25.

［22］王永军，卢宁，田秀娥，等.日粮系酸力水平对羔羊生产性能和养分表观消化率的影响［J］.动物营养学报，2009，21(4):488-492.

［23］BOSI P，JUNG H J，HAN I K，et al.Effects of dietary buffering characteristics and protected or unprotected acids on piglet growth，digestibility and characteristics of gut content［J］.Asian-Australian Journal of Animal Science，1999，66:1104-1110.

［24］BOSI P，CASINI L，FINAMORE A，et al.Spray-dried plasma improves growth performance and reduces inflammatory status of weaned pigs challenged with enterotoxigenic Escherichia coli K88［J］.Journal of Animal Science，2004，82(6):1764-1772.

［25］RUNGRUANGSAK K，UTNE F.Effect of different acidified wet feeds on protease activities in the digestive tract and on growth rate of rainbow trout(Salmo gairdneri Richardson)［J］.Aquaculture，1981，22(1):67-79.

［26］MUÑOZ M，CEDEÑO R，RODRIÍGUEZ J，et al.Measurement of reactive oxygen intermediate production in haemocytes of the penaeid shrimp，Penaeus vannamei［J］.Aquaculture，2000，191(1/2/3):89-107.

［27］TRAYSTMAN R J，KIRSCH J R，KOEHLER R C.Oxygen radical mechanisms of brain injury following ischemia and reperfusion［J］.Journal of Applied Physiology，1991，71(4):1185-1195.

［28］张纯，温安祥.绿原酸对建鲤生长、非特异性免疫功能和抗氧化能力的影响［J］.四川农业大学学报，2012，30(1):92-97.

［29］吴军林，吴清平，张菊梅.L-苹果酸对老年大鼠组织中转氨酶活性的影响［J］.食品科学，2007，28(10):507-509.