捕食线虫真菌丝氨酸蛋白酶PII结构的同源模建

杨力权，桑 鹏，李珍贵

（1.大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003;2.云南大学云南省生物资源保护与利用重点实验室,昆明 650091）

捕食线虫真菌通过菌丝变态形成的各种捕食器官，如收缩性环或非收缩性环、黏性分枝、黏性菌结、黏性菌网等捕食线虫〔1〕。少孢节丛胞菌是捕食线虫真菌的代表种类，PII（EC3.4.21）是从少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）液体培养物中分离出的具备杀线虫活性的胞外丝氨酸蛋白酶〔2〕。它可以固定线虫并降解线虫表皮，具有高效杀线虫活性，因此被认为是真菌侵染线虫过程中重要的毒力因子之一。目前，通过基因工程技术已经对PII的基因克隆和异源表达进行了研究；同时，PII的氨基酸序列也已经获得，对其蛋白酶的物理化学特征、反应优化条件、底物特异性等也进行了一定研究〔3〕。但由于其晶体结构未被测定，因此对其催化性能及机理，以及结构和功能关系还未进行广泛深入的研究。本文通过同源模建技术构建蛋白酶PII的三维结构模型并对其结构进行分析，为在分子水平上研究杀线虫机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 原理 同源模建〔4〕是基于序列-结构相似性原则，通过模板蛋白构建待测蛋白质的三维结构模型。当蛋白质序列的一致性大于30%，便可以利用模板蛋白的结构来建立靶蛋白的三维结构〔4〕。同源模建的原理基于两点：蛋白质的结构由其氨基酸序列唯一决定；蛋白质的结构在进化中更稳定，结构变化比序列变化要慢得多，因此序列上的相似性导致同源蛋白具有相似的三维结构，并且进化上距离较远的相关序列仍可折叠成相似的结构。

1.2 序列比对和模板蛋白 在UniProtKB数据库中获得PII的序列，去掉信号肽和先导肽残基，得到包含286个氨基酸残基的成熟PII序列。在Biology Workbench生物平台中〔5-6〕，以成熟PII的序列作为查询序列，使用PSI-BLAST〔6〕进行序列搜寻和比对，得到的最接近序列为PDB编号3F7M的序列。PII与3F7M的序列比对结果显示，序列一致性达到45%（Identities=131/287（45%），Positives=177/287（61%），Gaps=16/287（5%））。3F7M〔7〕是由刀孢轮枝菌分泌出来的体壁降解丝氨酸蛋白酶Ver112（EC3.4.21），包含279个氨基酸。由于PII与Ver112具有较好的序列一致性，选取Ver112的晶体结构作为模板蛋白。

1.3 同源模建及能量优化 本文采用专业同源模建软件Modeller9.11〔8〕来构建蛋白酶PII结构模型。使用自行编写的Modeller脚本文件“align2d.py”对靶序列PII与模板序列3F7M进行序列比对，比对后进行手工调整使两者的保守位置尽量对齐，以保证模建结构的准确。随后用自行编写的Modeller脚本文件“model-single.py”，生成5个PII结构模型，采用模拟退火算法对结构进行能量优化，采用分子概率密度函数molpdf对模型进行评估。

2 结果和讨论

2.1 模建结构模型的评估 把能量最小化后的PII分子结构模型用Procheck〔9〕进行模建结构的评价。得到了相应的评价结果和Ramachandran图（见图1）。结果显示，其中86.8%的氨基酸处于最适区，9.9%处于较合适区，2.5%处于可接受区，0.8%处于不合理区。由此可见，99.2%的氨基酸残基分布在Ramachandran图的二面角合理区域，也就是说99.2%的氨基酸构象是可以接受的，说明模建的结构合理。

图1 PII模建结构模型的Ramachandran图

2.2 蛋白酶PII结构模型分析 蛋白酶PII的结构模型包含6个α螺旋，2个3/10螺旋，1个7链平行β片层和1个双链反平行片层，催化三聚体由Asp 41，His77和Ser230组成（见图2）。两段氨基酸残基108-111和136-139组成了PII的底物结合区域，在Ver112晶体结构中存在两对二硫键，而在PII结构模型中没有发现二硫键存在。

图2 蛋白酶PII的结构模型

整体上看，蛋白酶PII的结构模型具有枯草杆菌丝氨酸蛋白酶特有的α/β脚手架折叠模式；具有完全保守的催化三聚体和氧负离子孔结构组织，以及同样具有上下两部分α螺旋与中间的7股平行β折叠片组成的三明治结构。对于像丝氨酸蛋白酶这类的蛋白酶，一般都具有一个坚固的球状折叠构型，其中多种因素共同维系和影响着结构的稳固，如二硫键、范德华力、疏水作用力、氢键、盐键、芳香环堆积和钙离子的结合等。整体结构的稳定性保证其不易被自身和其它蛋白酶水解，但在结合位点等局部区域又必须具备一定的构象柔性，以保证其催化功能的发挥。结合位点的构象柔性越大，其催化活性越强，而二硫键在保证整体结构稳定性和局部构象柔性上都有重要作用〔10〕。实验测定数据表明，Ver112比PII具备更强的杀线虫活性。结合两者的三维结构，由于PII不具备二硫键，将可能导致其全局结构稳定性和结合位点的构象柔性低于Ver112，从而影响其杀线虫活性，这也从结构的层面解释了Ver112比PII具备更强的杀线虫活性。本文的研究结果将为进一步深入研究PII的结构和功能之间的关系奠定结构基础。

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