小白杏杏仁油免疫调节及对S180肉瘤抑制作用研究

田洪磊 张 灏 田丰伟

(食品科学与技术国家重点实验室江南大学食品学院1，无锡 214122)

(石河子大学食品学院2，石河子 832000)

新疆小白杏属蔷薇科李属(Rosaceaa，Prunus)，其杏仁油制品是新疆少数民族居民长期食用的特色药食两用资源，其中主要含有多种不饱和脂肪酸、植物甾醇、维生素E等，新疆维吾尔民族普遍将小白杏杏仁油作营养滋补品，也是一种维吾尔药物，除了具有补脑安神、益肾生精、抗突变等作用外，在免疫调节和抗肿瘤方面的作用受到疆内外医药领域广泛关注［1－2］。目前新疆小白杏仁油的免疫调节及抗肿瘤作用的研究尚未见报道。本试验在建立免疫力低下试验大鼠模型的基础上，研究明晰新疆小白杏杏仁油的免疫调节作用，并对体外培养的S180肉瘤细胞的抑制作用进行了初步探讨，以期为深入解析小白杏杏仁油免疫调节与抗肿瘤作用的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样本与试剂

小白杏杏仁油由石河子大学农产品加工与贮藏重点实验室制备提供;注射用环磷酰胺:上海华联制药有限公司;S180细胞株由石河子大学医学院药理基础实验室提供;大鼠血液免疫因子检测试剂盒:南京建成生物工程研究所;MTT生化试剂:美国Sigma公司;RPMI1640试剂:美国GIBCO公司;胎牛血清:杭州四季青生物材料研究所;其他试剂均为分析纯。

1.1.2 试验动物与饲养条件

SPF级雄性昆明种大鼠60只，由新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供［动物生产许可证号:SCXY(新)2011－0004］;动物饲养在新疆医科大学第一附属医院动物实验中心动物饲养房［许可证号:SYXK(新)2010－0003］内进行，采用笼具饲养的方法，环境温度为22～25℃，湿度为50%～65%，自然光照(12 h/d)，自由进食饮水［3－4］，适应性喂养7 d后，开始正式试验。

1.1.3 试验仪器与设备

HA121－50－02型超临界萃取设备:江苏华安科技股份有限公司;Multifuge X3R台式冷冻离心机:美国Thermo scientific公司;MCO－15AC型CO2培养箱:上海华耀贸易有限公司;96孔细胞培养板:丹麦NUNC公司;TS100/100－F型倒置显微镜:尼康仪器上海有限公司;XG－VS超净工作台:江阴市净化设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 小白杏杏仁油制备方法

从新疆轮台县小白杏种植示范园区采集成熟的小白杏鲜杏，整理收集小白杏杏仁，清水处理后进行烘箱干燥［干燥温度(50±2)℃］，并将其粉碎至30目;在萃取温度为35℃、萃取压力为30 MPa、CO2流速为18 L/h的条件下萃取3 h进行小白杏杏仁油样品制备，并采用课题组前期建立的气相色谱－质谱(GC－MS)检测方法［5］，对其脂肪酸组成进行了分析，分析结果如表1所示。

表1 新疆小白杏杏仁油超临界CO2萃取样品的脂肪酸组成

制备样品－20℃条件下贮存为后期动物试验备用，并经新疆医科大学第一附属医院动物实验中心动物实验伦理委员会审核批准，设计本次研究方案及操作流程。

1.2.2 动物模型建立与分组

采用环磷酰胺诱导的方法建立免疫力低下大鼠模型，将环磷酰胺干粉配成4 mg/mL的生理盐水溶液，按照40 mg/kg标准对大鼠进行腹腔注射，每周各间隔2 d注射2次即可建模，为维持免疫力低下状态，灌服对照喂养阶段继续每周2次注射环磷酰胺，直至本项研究结束［6－8］;试验起始首先按上述方法建立免疫力低下大鼠模型后，将试验大鼠随机分成3组(正常大鼠空白对照组、大鼠模型对照组及大鼠模型样品喂养组)，每组各20只，其中样品喂养组每日按5 mL/100 g灌胃，其他两组按相同体积生理盐水灌胃对照，喂养28 d后采集检测样本。

1.2.3 大鼠免疫器官指数测定

末次灌胃24 h后称重，乙醚麻醉试验大鼠，迅速取出脾脏、胸腺及肝脏，用滤纸吸干血迹后称重，按如下方式计算脏器指数(mg/g):脏器指数=脏器质量/体质量［9－11］。

1.2.4 大鼠血清免疫调节因子检测

采用心脏取血－抗凝储存的方法制备各组血浆样品，在0℃条件下离心分离(3 000 r/min)10 min，获得待检血清，采用酶联免疫吸附法(ELIAS)，按试剂盒说明书方法检测大鼠血清中IgA、IgM、IgG、IL－2、IL－12及 TNF －α 的表达水平［12－13］。

1.2.5 S180细胞的培养

在蒸馏水中加入胎牛血清(FBS)配制浓度为10 ml/L的S180细胞培养液(RPMI1640)，并分别加入青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL进行压滤除菌;在37℃、5%CO2培养箱中进行细胞培养，通过MTT检测取呈对数生长的浓度为1×105个/mL的S180细胞悬液，于96孔培养板铺板，每孔加入细胞悬浮液200 μL，用200 μL 50%小白杏仁油的四氢呋喃(≤0.5%)溶液作用于 S180细胞，并做阴性对照，于37℃、5%CO2培养箱培养48 h，倒置显微镜下观察 S180细胞细胞形态并拍照(放大400倍)［14－16］。

1.3 统计学分析

试验数据处理均采用SPSS 20.0软件处理，所有数据均进行3次平行试验，并进行t检验，试验数据结果以均数±标准差(±SD)表示，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01表示有较显著性差异，P＜0.001表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 新疆小白杏杏仁油对环磷酰胺诱导的免疫力低下大鼠生长的影响

动物试验开始首先建立各对照组生长状况档案，在每周周末清晨称重，并统计1周的采食量，计算对照组体重平均值及平均采食量，统计结果如表2所示。

表2 新疆小白杏杏仁油对环磷酰胺诱导的免疫力低下大鼠体重和采食量的影响

根据表2统计数据分析，试验期间各对照组试验大鼠体重呈现差异性变化，其中正常大鼠空白对照组(BS)平均体重增长速度最快，大鼠模型对照组(MC)增长最为缓慢，与正常大鼠空白对照组(BS)相比呈显著性(P＜0.05)减重趋势;大鼠模型样品喂养组(SF)平均体重增长速度较快，与大鼠模型对照组(MC)相比呈显著性(P＜0.05)增重趋势。差异的饲养方式同样导致对照组试验大鼠的平均采食改变，大鼠模型样品喂养组(SF)的采食量明显(P＜0.05)低于大鼠模型对照组(MC)的采食量，说明小白杏杏仁油在降低动物的基础采食量情况下，可能由于改善了免疫力低下模型大鼠的免疫表达系统而努力维持了机体的生理功能。

2.2 新疆小白杏杏仁油对环磷酰胺诱导的免疫力低下大鼠免疫脏器指数的影响

按照1.2.2节方法分组试验，对照饲养结束后采用乙醚麻醉进行心脏取血(用于后期血清免疫因子检测)，并取出脾脏、胸腺及肝脏称重，计算免疫器官指数，结果如表3所示。

表3 新疆小白杏杏仁油对环磷酰胺诱导的免疫力低下大鼠免疫脏器指数影响

由表3试验结果所示，与正常大鼠空白对照组(BS)相比，大鼠模型对照组(MC)胸腺指数(P＜0.01)、脾脏指数(P ＜0.001)及肝脏指数(P ＜0.05)显著降低，差异结果具有统计学意义;与大鼠模型对照组(MC)比较，大鼠模型样品喂养组(SF)脾脏指数(P ＜0.01)、胸腺指数(P ＜0.01)及肝脏(P ＜0.05)均具有明显增加，显现出可靠的统计学意义。说明采用此方法可以造就大鼠免疫力低下模型，且新疆小白杏杏仁油对机体免疫器官具有增值的作用。

2.3 新疆小白杏杏仁油对环磷酰胺诱导的免疫力低下大鼠血清免疫因子的调节作用

采用酶联免疫吸附法(ELIAS)研究新疆小白杏杏仁油对大鼠血清免疫因子的调节作用，按试剂盒说明书方法检测大鼠血清中相关免疫因子的表达水平，结果如图1、图2所示。

从图1、图2可以看出，模型对照组(MC)与空白对照组(BS)相比较，大鼠血清免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)及其他免疫因子(IL－2、IL－12、TNF－α)含量明显降低，其中模型组中IgA与IgM的差异表达呈现极显著的水平(P ＜0.001)，IgG、IL－2、IL－12及TNF－α的差异表达呈现较显著水平(P＜0.01)，差异具有统计学意义，可以说明采用此种方法已成功建立免疫力低下大鼠模型;样品喂养的模型组(SF)与模型组比均有不同程度的提高，其中小白杏杏仁油对IgA、IgM、IgG及IL－12指标的改善程度达到较显著差异水平(P＜0.01)，唯有IL－2和TNF－α指标的改善程度相对较低，但也呈现显著差异水平(P＜0.05)，以上结果提示新疆小白杏杏仁油对环磷酰胺诱导的免疫力低下大鼠具有明显的免疫调节作用。

2.4 新疆小白杏杏仁油对S180肉瘤体外抑制作用

用200 μL 50%小白杏仁油的四氢呋喃(≤0.5%)溶液及相同体积四氢呋喃(≤0.5%)溶液分别作用于S180细胞的试验组和阴性对照组，结果如图3、图4所示。

观察结果表明，添加小白杏杏仁油试验组与其阴性对照组相比，细胞数量明显减少，初步说明新疆小白杏杏仁油具有抑制S180细胞生长的作用，其抑制作用机制有待通过S180肉瘤大鼠模型进一步深入研究。

3 讨论与结论

本试验采用环磷酰胺诱导腹腔注射及S180肉瘤细胞体外培养观察的方法研究了新疆小白杏杏仁油免疫调节及抑制肿瘤细胞生长的作用，试验结果表明新疆小白杏杏仁油对免疫力低下大鼠模型的脾脏、胸腺及肝脏等机体免疫器官具有增殖的作用，而且能够提升大鼠血清免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)及其他免疫因子(IL－2、IL－12、TNF－α)的表达，其中小白杏杏仁油对IgA、IgM、IgG及IL－12指标的改善程度达到较显著差异水平(P＜0.01);通过体外细胞培养观察新疆小白杏杏仁油具有抑制S180细胞生长的作用，为深入解析小白杏杏仁油免疫调节与抗肿瘤作用的分子机制奠定基础。

小白杏杏仁油的免疫调节作用及对S180肉瘤细胞的抑制作用可能与其所含的营养成分有关，尤其是多种不饱和脂肪酸与各项免疫因子之间可能存在差异性的构效关系。在增强膜的流动性的前提下特异不饱和脂肪酸能够增强巨噬细胞的吞噬能力，与此同时降低膜的脂质过氧化程度，从而改善机体免疫因子的表达水平［17－18］。Wooki等［19］的研究也表明多不饱和脂肪酸通过抑制机体炎症因子表达而对免疫细胞功能产生影响。在此期间不排除协同调节作用方式的可能，不饱和脂肪酸首先与相应靶细胞膜上的受体结合，并以信号传递分子的形式，通过细胞表达因子介导和调节机体免疫应答［20］。因此，机体免疫应答的产生及细胞因子的相互作用与平衡构成了复杂的网络体系。有关新疆小白杏杏仁油的免疫调节及对S180肉瘤细胞抑制的作用机制目前尚未完全清楚，不饱和脂肪酸单体或体系是否与某些细胞因子之间存在某种特殊的构效关系或协同关系有待进一步研究，为明确小白杏杏仁油的的免疫调节及抑制肿瘤细胞生长的功效因子及其作用机制，课题组将以已建立的小白杏杏仁油活性物质指纹图谱库为基础，并结合相关数学模型深入研究其构效相关性，为新疆小白杏种植资源改良及产品升级奠定良好的理论基础。

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