花椒精油抑制赤拟谷盗虫卵孵化作用的研究

赵雪娜 王建清

(天津科技大学包装与印刷工程学院，天津 300222)

赤拟谷盗［Tribolium castaneum(Herbst)］为世界性主要的储粮和干货类害虫，尤其在高温高湿情况下，极易发生虫蛀危害。目前，主要采用磷化氢熏蒸防治，但长期过度使用导致其产生了不同程度的抗药性［1］，而且也无法避免在之后的运输贮藏过程中的虫害发生。近年来，植物精油对赤拟谷盗的活性研究在国内外已有报道，具有忌避、熏蒸与触杀作用［2－8］，它低毒、绿色;且由于精油的独特作用机理，不易产生抗性，既能拓宽精油的用途，又能开创防虫包装的新途径，因此具有广阔的应用前景。

本研究提取了不同产地的4种花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)精油，通过对赤拟谷盗虫卵孵化的抑制作用研究，筛选出效果最好的精油，并对其杀虫活性进行了进一步地研究，为开发新型无公害的杀虫剂，研究防虫包装提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试虫卵

赤拟谷盗，取自国家粮食局科学研究院，实验室饲养，即将赤拟谷盗成虫接种于以全麦粉和酵母粉按质量比为20∶1混合而成的饲料中，在(30±1)℃、相对湿度(75±5)%、24 h黑暗条件下进行种群培养［9］，待成虫大量出现时，每日筛出供试1日虫卵。

筛卵方法:将小麦和酵母粉粉碎，过100目分选筛，配制比例为20∶1、粒径小于0.15 mm 的饲料，调整水分13%左右;将成虫接入饲料中，产卵24 h后，先过尼龙纱网，将成虫筛去;取混有卵的饲料过80目筛，筛上留下的是卵和少量的饲料，筛下的饲料中无卵遗留，可重新饲养成虫;将载有卵的少量饲料再过60目筛，分选筛上留下的即是1日龄卵(筛下的饲料去除，不再回收入成虫饲料中)。

1.1.2 供试药剂

东北青花椒、江津青花椒、汉源红花椒、韩城红花椒:安国市祁奥中药饮品有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 4种花椒精油的水蒸气蒸馏提取

将花椒粉碎过筛，粒径30目左右，裁出适当大小的双层纱布置于1 000 mL的加料瓶底部，然后将100 g花椒粉末用漏斗装于纱布上。底部1 000 mL的三口烧瓶中装入约为2/3容积的蒸馏水，加入适量的沸石，三口瓶的一侧装入安全管，另一侧装入传感器(测温度)。用加热套加热，铁架台固定，然后按图1将水蒸气蒸馏装置组装完成［10］。加热套的温度设定为110℃，蒸馏水沸腾后，挥发油测定器里开始有挥发油的油水混合物滴出，适时补充三口烧瓶中的蒸馏水，当蒸馏出的精油不再增加时停止蒸馏。

将蒸馏液取出，用无水硫酸钠去掉水分，即得花椒精油。前30 min每1 min记录提取率，30～120 min每10 min记录提取率，120～300 min每30 min记录提取率。

图1 新型的水蒸气蒸馏装置

1.2.2 4种花椒精油的GC－MS成分分析

采用气相色谱－质谱联用技术(GC－MS)对提取的东北青花椒、江津青花椒、汉源红花椒、韩城红花椒精油的成分进行分析。

色谱条件:柱子型号:VF －5ms，30 m ×0.25 mm×0.25 μm，进样口温度300 ℃，分流比20，载气 He，纯度99.999%，柱流速1 mL/min;程序升温:初始温度60℃，以5℃/min升到200℃，以10℃/min升到300 min，保持 3 min。

质谱条件:离子源:EI，质量分析器:离子阱，阱温:220℃，传输线温度:280℃，扫描方式:全扫描，扫描范围:50～1 000 m/z。

数据库:利用NIST05标准质谱库－计算机联机检索。

样品的处理及测定:取4种精油用正己烷分别稀释10 000倍，各取1μL进样。利用NBS75K标准质谱库－计算机联机检索，与质谱图集的标准谱图进行对照、复合，再结合有关文献，进行人工谱图解析，确认4种精油的各个化学成分。按面积归一化法进行成分含量分析，分别计算各个成分的相对百分含量。

1.2.3 熏蒸试验

对传统的成虫三角瓶熏蒸法［11］进行了改进，以适用于虫卵的熏蒸，具体熏蒸方法如下:在载玻片上贴附双面胶用于固定虫卵，用刀片划分为4格，用毛笔将40粒卵轻轻拨入每格，即每个处理重复4次。将载有卵的载玻片置于250 mL三角瓶的底部，不同量的精油滴于尺寸为1 cm×4 cm的滤纸片上，滤纸片的一端固定在7层共挤薄膜的内表面，使之悬空于三角瓶内，用透明胶带封合薄膜和三角瓶，保持熏蒸环境密闭。熏蒸48 h后将载有卵的载玻片取出，置于(30±2)℃、相对湿度(70±5)%环境下培养，记录卵的最终孵化率。

1.2.4 触杀试验

滤纸药膜法［12］(直径 90 mm，面积 63.5 cm2):用丙酮将精油配成不同浓度的溶液，取1 mL溶液加入到培养皿中的滤纸上，制成滤纸药膜，待溶剂挥发后(1 h)，每皿接入40粒卵，每个浓度3个重复试验，处理24 h后取出，置于(30±2)℃、相对湿度(70±5)%环境下继续培养，记录卵最终孵化率。

1.2.5 数据处理

试验结果数据处理采用了EXCEL统计软件进行数据分析。

死亡率=死亡虫数/供试虫数×100%

采用Abbott公式对死亡率进行校正:

校正死亡率=(处理死亡率－对照死亡率)/(1－对照死亡率)×100%［13］

用概率值法求出不同熏蒸处理时间和处理浓度下花椒精油的毒力回归方程和LC50值［14］。

2 结果与分析

2.1 花椒品种对精油提取率的影响

水沸腾后开始计时，4种花椒精油的提取率随时间的变化如图2。从图2可以看出，30 min内4种花椒精油的提取率升高较快，30 min时东北青花椒、江津青花椒、汉源红花椒、韩城红花椒的提取率分别是5%、3.7%、4.6% 和 1.1%，过后提取率趋于平缓。180 min时东北青花椒的提取率达到最高为7.2%，240 min时江津青花椒的提取率达到最高为5.1%，180 min时汉源红花椒的提取率达到最高为4.6%，120 min时韩城红花椒的提取率达到最高为2.0%。因此为了节约成本，试验中采用120 min来提取花椒精油，也可应用于工厂生产中。

图2 4种花椒精油的提取率变化曲线

2.2 4种花椒精油的主要化学成分分析

图3 4种花椒精油的总离子流图

4种花椒精油的总离子图谱如图 3，利用NBS75K标准质谱库－计算机联机检索，与质谱图集的标准谱图进行对照、复合，进行人工谱图解析，确认精油的主要化学成分，按面积归一化法进行成分含量分析，分别计算各个成分的相对百分含量。可以看出，东北青花椒、江津青花椒和汉源红花椒精油中含量最多的化学成分均是芳樟醇(出峰时间8.969 min)，相对质量分数分别为 68.46%、58.01% 和48.23%，其次是柠檬烯(出峰时间 7.234 min)，相对质量分数分别为 7.53%、9.96%和 19.66%，b －萜品烯(出峰时间 5.929 min)相对质量分数分别为4.13%、8.73%和14.97%。韩城红花椒精油中的各种化学成分含量都比较少，其中含量相对较高的是柠檬烯12.53%，其他含量比较多的成分包括(1R)－(+)－α蒎烯、b－萜品烯等，而芳樟醇仅占3.70%。芳樟醇和柠檬烯的分子结构式如图4。

图4 芳樟醇和柠檬烯的分子结构式

2.3 4种花椒精油对1日卵的熏蒸孵化抑制效果

4种花椒精油对1日卵熏蒸48 h后的校正死亡率如图5所示，从图5可以看出，随着精油熏蒸浓度的升高，卵的孵化率越来越低，校正死亡率越来越高，两种青花椒精油的效果要优于两种红花椒精油，青花椒精油熏蒸浓度54μL/L时卵的校正死亡率已经达到90%以上，其中东北青花椒精油对1日卵的孵化抑制效果是最佳的，致死率96.72%，而江津青花椒、汉源红花椒和韩城红花椒精油处理后，卵的校正死亡率分别为92.43%、88%和70.49%。

图5 4种花椒精油对赤拟谷盗虫卵熏蒸48 h后的毒力作用

4种花椒精油的熏蒸毒力回归方程和致死中浓度 LC50如表1，东北青花椒的 LC50是29.28 μL/L，明显低于其他3种花椒精油，对卵的孵化抑制效果最好，而韩城红花椒精油的杀虫效果最差。据文献报导，青椒精油对赤拟谷盗成虫和米象成虫的熏蒸效果优于红椒精油，且2种花椒精油的持续期长，在高温下能更好地发挥药效［15－16］。

表1 4种花椒精油对赤拟谷盗虫卵的熏蒸毒力(48 h)

空白对照组和熏蒸处理组的虫卵孵化如图6(放大1 000倍)。空白对照组的虫卵正常孵化，在显微镜下可以清晰地看到破裂的卵壳和孵化出的幼虫，随着精油熏蒸浓度的升高，孵化率随之下降，当精油熏蒸浓度提高到42μL/L时，卵内细胞质开始皱缩，54μL/L精油处理后，细胞质皱缩率达到50%左右，卵无法孵化。

图6 东北青花椒精油熏蒸处理后的虫卵

2.4 4种花椒精油对1日卵的触杀试验

4种花椒精油对1日卵进行触杀试验后的校正死亡率如图7所示。从图7可以看出，随着精油触杀用量的升高，卵受到精油的致死影响，孵化率越来越低，校正死亡率越来越高。每个用量下东北青花椒精油的致死效果都是最好的，江津青花椒和汉源红花椒效果相近，而韩城红花椒在低用量时触杀效果较差。当东北青花椒精油触杀用量3.6μL/cm2时，对1日卵孵化的抑制率高达97.85%。另外3种花椒精油校正死亡率为85.71%、86.44%和85.23%，还未完全抑制卵的孵化繁殖。

图7 4种花椒精油对赤拟谷盗虫卵的触杀毒力作用

4种花椒精油的触杀毒力回归方程和致死中量LD50如表2，东北青花椒的 LD50是1.02 μL/cm2，明显低于其他3种花椒精油，杀虫效力最佳。与熏蒸毒力效果类似，韩城红花椒的毒力效果较差。

表2 4种花椒精油对赤拟谷盗虫卵的触杀毒力

综合熏蒸试验结果和触杀试验结果，选定东北青花椒精油进行后续研究，探索其对赤拟谷盗虫卵的毒力效果。通过GC－MS分析结果看，东北青花椒精油中芳樟醇含量最高，江津青花椒和汉源红花椒精油次之，韩城红花椒精油最少，从杀卵效果来看，前3者也较好，而韩城红花椒精油效果最差。另外，虽然后3者的柠檬烯含量较高，但是杀虫效果却次于东北青花椒精油。由此可以看出花椒精油中芳樟醇对赤拟谷盗虫卵的孵化抑制效果是最明显的，是杀卵的主要成分。这与路春明等［4］的研究成果类似。

2.5 在不同熏蒸时间下，东北青花椒精油熏蒸浓度对赤拟谷盗虫卵熏蒸毒力的影响

东北青花椒精油熏蒸24 h的熏蒸浓度设定为30、36、42、48、54、60、66 μL/L，熏蒸 48 h 的熏蒸浓度设定为18、24、30、36、42、48、54 μL/L，熏蒸72 h 的熏蒸浓度设定为 6、12、18 、24、30、36、42 μL/L，如图 8，精油熏蒸浓度为54μL/L时，熏蒸24 h后使得虫卵的校正死亡率达到了94%，48μL/L时熏蒸48 h后校正死亡率达到91%，差别不是特别大，但是当熏蒸时间达到72 h后，36μL/L的精油熏蒸浓度可以达到95%的致死率，杀虫效力大大增加，也就是随着精油熏蒸浓度的增加，较短的时间就可以达到较高的致死效果。

图8 东北青花椒精油熏蒸浓度对赤拟谷盗虫卵的毒力影响

东北青花椒精油的熏蒸毒力回归方程和致死中浓度LC50如表3。随着时间的延长，LC50值逐渐减小，并且熏蒸72 h与48 h和24 h的LC50差别比较大，熏蒸活性增幅明显，说明精油效果具有较长的持续期，熏蒸时间越长效果越好，因此，适当延长熏蒸时间可以减少用药量。

表3 东北青花椒精油熏蒸时间对赤拟谷盗虫卵的毒力

2.6 在不同熏蒸浓度下，东北青花椒精油熏蒸时间对赤拟谷盗虫卵熏蒸毒力的影响

2.6.1 东北青花椒精油对1日卵熏蒸试验

用20、30、40、50 μL/L 的精油对1 日卵进行 12、18、24、36、42、48、60、72 h 的熏蒸，确定其校正死亡率达到50%的时间段。如图9，在熏蒸浓度为20 μL/L时，熏蒸72 h后的校正死亡率为45.38%，还没有达到50%的致死率，可以去除这个浓度。熏蒸浓度为30μL/L时，在42～60 h中，校正死亡率由45.86%升至 63.91%;熏蒸浓度为 40 μL/L时，在18 ～36 h中，校正死亡率由 40.77%升至 56.92%;熏蒸浓度为50μL/L时，熏蒸18 h后，校正死亡率达到60.90%。因此，选定精油熏蒸浓度为30、40和50 μL/L，熏蒸时间段分别为42～60 h、18～36 h和1～19 h进行致死中时间LT50的测定。

图9 东北青花椒精油熏蒸时间对赤拟谷盗虫卵的毒力影响

2.6.2 东北青花椒精油对1日卵熏蒸致死中时间LT50的测定

3种浓度的精油对1日卵进行熏蒸处理，精油熏蒸浓度为 30 μL/L 时分别熏蒸 42、44、46、48、50、52、54、56、58、60 h;40 μL/L 时分别熏蒸 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h;50 μL/L 时分别熏蒸 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 h;通过对不同浓度的东北青花椒精油的熏蒸毒力进行回归分析，结果如表4。熏蒸浓度为30μL/L的LT50为45.11 h，40 μL/L的 LT50为 29.41 h，50 μL/L 的 LT50为12.98 h，因此东北青花椒精油熏蒸浓度和赤拟谷盗虫卵的活性有密切的关系，可以根据实际需要，选择合适的熏蒸浓度和熏蒸时间，达到较好的熏蒸效果。

表4 东北青花椒精油熏蒸浓度对赤拟谷盗虫卵的毒力

3 结论

从研究结果可以看出，花椒精油的提取率比较高，工业生产中可以提取120 min以节约成本。4种花椒精油对赤拟谷盗虫卵的孵化具有较好的抑制作用，尤其是东北青花椒精油的效果更佳，提取率更高。试验在250 mL空三角瓶中研究了东北青花椒精油对赤拟谷盗1日卵的熏蒸效果，熏蒸24、48和72 h 的 LC50分别为 34.82、29.28 和 16.48 μL/L，熏蒸时间越长，所需的精油浓度依次降低。精油熏蒸浓度分别为30、40和50μL/L时致死中时间LT50分别为45.11、29.41 和 12.98 h。精油熏蒸浓度越高，达到抑制效果的时间越短，这对于之后在储粮或干货防虫方面的实际应用提供了指导意义。国内外针对赤拟谷盗的研究主要涉及幼虫和成虫方面的研究，对赤拟谷盗虫卵的研究较少，植物精油对于虫卵的效果相对较差，但作为储粮防虫以及防虫包装方面，需要从虫卵态开始进行抑制，因此本研究改进了虫卵的熏蒸方法，为植物精油在虫卵熏蒸方面的应用提供了理论依据。

针对本研究结果，今后需要继续深入研究的问题主要有实仓中精油的渗透力、应用对象对精油的吸附、温度等的影响对花椒精油熏蒸浓度和熏蒸时间的影响，并探索应用于防虫包装中，代替目前的化学熏蒸剂，提高植物杀虫剂的应用实践价值。

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