酶法修饰抑制小麦淀粉回生工艺优化及机理探讨

熊 柳 南 冲 孙庆杰 李凡飞

(青岛农业大学食品科学与工程学院，青岛 266109)

新制作面包、馒头、蛋糕等面制品都具有内部组织结构松软、有弹性、口感良好的特点;但随着贮存时间的延长，就会由软变硬，组织变得松散、粗糙、弹性和风味也随之消失，降低食品的营养价值和感官品质，这就是食品的回生(老化)现象［1］。这些面制品的回生主要是由于其中所含的淀粉回生引起的。淀粉的回生包括直链分子螺旋结构的形成及其堆积、支链淀粉外支链间双螺旋结构的形成与双螺旋之间的有序堆积［2］。直链淀粉分子长短及直、支链的比例与回生速率呈高度相关，可由消除或抑制支链淀粉分子结晶的形成来抑制淀粉质食品的回生［3］。目前，抑制淀粉回生的主要方法有基因修饰、酶法修饰、化学修饰、物理修饰［4］。但是基因修饰的方法抑制淀粉回生，所要求的技术和成本都很高，化学修饰易产生毒性和带来食品安全问题，物理修饰中的添加食品添加剂如海藻糖、亲水性胶体、乳化剂、多糖类、低聚糖、食用胶类和变性淀粉等，尽管这些添加剂对淀粉的回生有一定的抑制作用，但效果远达不到人们所希望的效果;因此，这些方法在食品工业的应用大大受的限制。酶法修饰是指用酶水解淀粉物质，但保持或至少保持淀粉颗粒结构或分子的层次结构。有研究指出生物酶法是一种很好的抑制淀粉回生的方法，通过在馒头、面包和米粉等的制作过程中添加淀粉酶，可有效延长米面制品的保鲜时间，是一种较具有前途的方法［5］。

Hardeep SG［6］研究认为在面包贮藏后期，支链淀粉的凝沉作用是影响面包老化的主要因素。α－淀粉酶能使支链淀粉在糊化时侧链变短，从而降低支链淀粉分枝部分相互合并重结晶的机会，从而延缓面包老化。木伍六司［7］通过研究α－，β－和葡萄糖淀粉酶对米饭硬化回生的影响后认为:β－淀粉酶可以显著抑制米饭的回生硬化。丁文平等［8］在普鲁兰酶和β－淀粉酶对大米支链淀粉回生影响的研究中指出，β－淀粉酶能够通过切短大米支链淀粉外侧枝健而抑制其回生，且随着酶解度的增加回生抑制更加明显。孙庆杰等［9］通过β－淀粉酶对米粉进行抗回生处理后，生产的保鲜米制品1年内不回生。以上研究主要说明了淀粉酶对于淀粉回生具有抑制作用，酶抑制淀粉回生的机理及酶处理后淀粉的化学结构的变化未作深入研究。孙玲玲等［10］对β－淀粉酶抑制糯米支链淀粉回生工艺通过响应面法进行了优化，得出β－淀粉酶抑制糯米支链淀粉回生时最佳工艺条件为:酶浓度0.111%，温度59.8℃，时间41.4 min。但国内并未有对β－淀粉酶抑制小麦淀粉回生工艺优化的研究。

因此，本研究在前人研究基础上，以小麦淀粉为原料，采用β－淀粉酶对其进行抗回生处理。采用响应面分析法优化β－淀粉酶抗小麦回生工艺条件;并通过测定在最佳工艺条件下处理后的小麦淀粉中还原糖和直链淀粉含量及支链淀粉平均侧链长度，初步探讨β－淀粉酶抑制小麦淀粉回生的机理，为今后β－淀粉酶抑制淀粉质食品回生的工业化提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

直链淀粉标样、支链淀粉标样、β－淀粉酶(酶活力1 771.2 U/g):美国Sigma公司;右旋糖苷标准品:瑞典Pharmacia公司;二甲基亚砜、氯化钙、盐酸、3，5－二硝基水杨酸、丁醇、氢氧化钠、无水乙醇、异戊醇、碘、碘化钾均为分析纯。

1.2 试验设备

101－1型恒温干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;冰箱:中国海尔集团公司;红外水分测定仪:北京赛多利斯有限公司;HH－S恒温水浴锅:金坛市医疗器械厂;755B型紫外可见分光光度仪:上海精密科学仪器有限公司;LD5－2A型离心机:上海安亭科学仪器厂;旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;质构测定仪(TA－XT.plus):英国 Stable Micro Systems公司;GPC－RI－DAWN EOS十八角度激光散射联用系统:美国怀雅特公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小麦淀粉的制备及脱脂

小麦淀粉的制备:以山东莱州市联合面粉厂提供的小麦粉为材料，根据梁玲等［11］提供的小麦淀粉的方法，实验室自制。根据国标提供的方法测得自制的小麦淀粉中含蛋白质0.28%、脂肪0.12%、无机盐 0.32%、水分 12.8%。

小麦淀粉的脱脂［12］:称取淀粉20 g溶于400 mL DMSO水溶液中，在90℃加热30 min，再加入2倍量95%乙醇使淀粉分子沉淀，收集沉淀，并在碾钵中碾成粉末，转移到布氏漏斗中，以无水乙醇洗涤，最后在CaCl2真空干燥器中干燥至恒重。

1.3.2 β－淀粉酶抑制小麦淀粉凝胶回生的处理工艺

称取一定量的小麦淀粉，加小麦淀粉质量1.2倍的水(pH保持不变)，搅拌均匀，沸水蒸汽中糊化3 min，冷却到40～50℃后，添加一定量的β－淀粉酶液(以添加同样量的蒸馏水作对照)，揉匀于一定温度下恒温放置一定时间，之后再沸水蒸汽中蒸3 min灭酶，冷却，做成质量相同、厚度均匀、表面平整的淀粉凝胶样品。

1.3.3 响应面法优化β－淀粉酶抑制小麦淀粉凝胶回生工艺

结合前人对酶抑制淀粉回生因素的研究及大量的预试验基础上，确定了酶作用时间(X1)、酶作用温度(X2)及酶浓度(X3)3个对β－淀粉酶抑制小麦淀粉凝胶回生效果影响显著的因素作为试验因素，淀粉凝胶硬度(Y)为响应值，根据单因素试验结果确定试验因素范围，分析设计三因素三水平试验。试验设计因素及水平编码见表1，数据采用SAS RSREG统计软件分析。

表1 试验因素水平及编码

1.3.4 小麦淀粉凝胶质构的测定

将经酶处理后小麦淀粉凝胶放于冰箱中，4℃保温48 h之后，采用TA.XT plus物性仪对制得的β－淀粉酶处理后小麦淀粉凝胶质构进行测定，主要参数为:运行模式:Texture Profile Analysis(TPA);试验前速:1.00 mm/s;试验速度:1.00 mm/s;返回速度:1.00 mm/s;测试距离:30.00%;感应力:Auto－10.0 g;两次压缩时间间隔 5 s;数据采集速率:200 point/s;探头:P35，探头高度为30 mm。测试完毕后利用质构仪分析软件得到硬度。以上试验重复3次取平均值。

1.3.5 直链淀粉与还原糖含量的测定

淀粉凝胶样品，用无水乙醇脱水后，50℃烘干，粉碎，过100目筛。直链淀粉含量的测定采用碘比色法［13］，于620 nm处测得吸光值，根据标准曲线求得试样中直链淀粉含量。还原糖含量的测定采用3，5－二硝基水杨酸比色法［14］，还原糖含量的计算公式:还原糖=(还原糖质量×样品的稀释倍数)/样品总质量×100%。

1.3.6 酶处理前后小麦淀粉中支链淀粉平均侧链长度的测定

将酶处理前后的淀粉样品用正丁醇－异戊醇法［15］分离纯化直链淀粉和支链淀粉。取酶处理前后支链淀粉6 mg于50 mL离心管中，加入0.5 mL 0.1 mol/L pH 5.0的乙酸钠缓冲液，95℃加热溶解30 min，冷却至室温，加入3 mL普鲁兰酶溶液(0.1 mol/L pH 5.0的醋酸钠缓冲液，700 IU)，混合均匀后在40℃水浴中震荡(150 r/min)水解24～30 h，然后再沸水浴灭酶10 min，冷却后离心。

采用蒽酮－硫酸法［16］测定总糖，得一个数据Gr(以葡萄糖的量表示);采用Somogyi法［17］测定还原末端的数量，得到一个数据GR(以葡萄糖的量表示)。按下式计算平均聚合度:

1.4 数据处理

采用Box－Behnken中心组合试验设计，对工艺条件进一步研究，以获得最佳工艺参数。采用Design Expert统计分析系统对试验数据进行多元回归拟合，建立二次响应面回归模型模型，并对拟合方程作方差分析，P ＜0.05为显著，P ＜0.01为极显著。

2 结果与讨论

2.1 响应面法优化β－淀粉酶抑制小麦淀粉凝胶回生工艺

2.1.1 响应面试验设计与结果

根据Box－Benhnken的中心组合试验设计原则，结合单因素试验结果，确定各个因素的选取范围区间，以响应面试验设计3次试验小麦淀粉凝胶的硬度(Y)的平均值为响应值，对显著影响酶抑制小麦淀粉回生效果的酶作用温度(X1)、酶作用时间(X2)和酶浓度(X3)3因素进行优化试验，试验设计及结果见表2。1～12号为析因试验，13～17号为5个中心试验，用以估计试验误差。

表2 试验设计及结果

应用Design Expert软件，对表2中的数据进行多元回归拟合，建立二次响应面回归模型模型如下:

对回归方程进行方差分析和显著性检测，结果见表3。

表3 方差分析表

由表3方差分析及显著性检验结果可知，该模型回归显著(P ＜0.000 1)。R2该模型的 R2=0.992 6，说明此模型与实际试验拟合较好，试验失拟项小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。回归系数显著性检验表明，在所选取的各因素水平范围内，对影响β－淀粉酶抑制小麦淀粉回生效果的3因素主次顺序依次是酶作用温度、酶作用时间、酶浓度。回归方程的各项方差分析结果表明:一次项和二次项都有显著性因素，因此各试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。所以，可以利用该回归方程确定处理的最佳条件。

2.1.2 响应面分析

利用Design－Expert软件进行响应面分析，结果如图1所示，在酶用量一定时，小麦淀粉凝胶硬度受酶作用温度与酶作用时间交互影响显著。凝胶硬度随酶作用温度的升高，呈先降低后增大的趋势。这是由于在一定温度范围内，随温度的升高，酶活增加，抑制小麦淀粉凝胶的回生效果增强，当温度超过一定值时，酶活降低或部分失活，故影响了酶对小麦淀粉凝胶回生的抑制效果。因此选择酶作用温度在56.5℃左右。在酶作用温度一定时，淀粉凝胶硬度受酶浓度与酶作用时间交互影响显著。随酶浓度和酶作用时间的延长，淀粉凝胶硬度降低。随时间的延长，酶对淀粉凝胶回生的抑制效果趋于完全，随着时间的继续延长，抑制回生效果变化不明显。在酶作用时间一定时，淀粉凝胶硬度受酶浓度与酶作用温度交互影响显著。随酶浓度的增大，淀粉凝胶硬度呈显著性降低，在浓度就一步增大时，硬度降低趋于平缓。这是由于随酶浓度的增大，酶解度逐渐增大达最大，之后趋于平缓。

由图1可知，酶作用温度对酶抑制小麦淀粉凝胶回生的效果最好，表现为曲线较陡。其次是酶作用时间和酶用量，表现为曲线较为平缓。经软件分析，优化的酶抑制小麦淀粉凝胶工艺条件为:酶作用温度56.5 ℃，酶作用时间32.3 min，酶浓度为34.33 U。

图1 因素相互作用对淀粉凝胶硬度的影响

2.1.3 β－淀粉酶抑制淀粉凝胶回生工艺参数优化结果验证

在选取的各因素范围内，根据二次回归的数学模型分析结果，最佳工艺条件:酶浓度34.33 U，酶作用温度为56.50℃，酶作用时间32.20 min。预测在此条件下的小麦淀粉凝胶硬度为5 302 g。为了证实预测的结果，用试验中得到的最佳工艺条件，重复试验3次，取平均值，得在4℃的冰箱中保温48 h后小麦淀粉凝胶硬度值为度为(5 342±7.82)g。与在此工艺条件下预测小麦淀粉中硬度值的相对误差仅0.75%。

未经酶处理的小麦淀粉凝胶硬度为(15 780.14±8.32)g，经β－淀粉酶处理后，小麦淀粉凝胶硬度降低了66.15%，β－淀粉酶抑制小麦淀粉凝胶回生效果显著。因此，该试验所得的数学模型和最佳工艺参数对于工业化应用β－淀粉酶抑制小麦淀粉回生具有更为准确的指导性，缩短生产周期，降低生产成本，延长淀粉质食品的货架期。

2.2 酶处理前后小麦淀粉中直链淀粉及还原糖含量

采用本试验中优化后的β－淀粉酶抑制小麦淀粉凝胶回生工艺，经碘比色法测得的酶处理前后小麦淀粉中直链淀粉含量和采用3，5－二硝基水杨酸比色法测得的还原糖含量见表4。

表4 酶处理前后小麦淀粉中直链淀粉和还原糖含量/g/100 g

从表4可以看出，酶处理后小麦淀粉中还原糖含量显著性升高，由酶处理前的0.30 g/100 g，增加到8.10 g/100 g。而直链淀粉含量显著性降低，由酶处理前的25.40 g/100 g，减少到21.80 g/100 g。其原因可能是β－淀粉酶从直链淀粉的非还原性末端以麦芽糖为单位被分解，造成生成麦芽糖的含量迅速升高。直链淀粉由于被部分水解，使得分子长度减小，与碘反应的颜色变淡，使侧得的直链淀粉含量降低。

大米淀粉的回生主要是由支链淀粉的重结晶引起，直链淀粉的含量与支链淀粉重结晶成核速率有显著正相关，但与支链淀粉最终重结晶程度没有显著相关;因此，可以推断直链淀粉通过参与支链淀粉晶核的形成来影响支链淀粉的重结晶过程，但不参与支链淀粉后期晶体的生长和稳定［12，18］。Gidley［19］研究认为直链淀粉分子间通过氢键形成双螺旋，在直链淀粉双螺旋富集区中氢键堆积形成结晶。Yu等［20］在研究中发现淀粉的回生焓随直链淀粉的含量增加而升高，回生焓值越高回生速率越快。

CGBiliaderis［7］以DSC法系统研究了各种糖类(多羟基化合物)对蜡性玉米淀粉结晶度的影响，研究指出，麦芽糖能有效的抑制淀粉的回生。本试验中，由于β－淀粉酶的对小麦淀粉的水解作用，缩短直链淀粉及支链淀粉直线分支的长度，减少其重结晶趋势，有效的抑制了淀粉的回生，且在同时产生的小分子糖亦有可能起到了抑制淀粉回生的作用。

2.3 小麦淀粉中支链淀粉平均侧链长度

测得的酶处理前后小麦淀粉中支链淀粉平均侧链长度见表5。

表5 酶处理前后支链淀粉平均侧链长度

由表5可知，小麦淀粉经β－淀粉酶处理后，支链淀粉平均侧链长度降低，支链淀粉侧链聚合度显著降低。Fredriksson等［21］在对直链淀粉与支链淀粉特性对淀粉回生影响的研究指出，淀粉的长期回生主要是由支链淀粉外侧短链的重结晶所引起，该过程是一个缓慢长期的过程。支链淀粉的结晶主要是通过支链淀粉外层短链以双螺旋为基质，通过氢键堆积而成。姚远［12］通过高效排阻色谱证实β－淀粉酶的处理可以使部分支链淀粉外侧短链聚合度降低2～3个葡萄糖单位。部分支链淀粉外侧短链聚合度降低，淀粉分子的成核和结晶速度降低，回生受到抑制。同时，有研究指出，β－淀粉酶可以抑制淀粉回生，主要是其能缩短支链淀粉的外链长度。因此，支链的长短与分布对支链淀粉的重结晶有重要影响［22］。与前人相关研究结果一致，本试验中结果显示，酶处理后样品中支链淀粉平均侧链分子长度降低，抑制了小麦淀粉的回生，从而使得酶处理后小麦淀粉凝胶硬度相比未经酶处理的小麦淀粉凝胶硬度显著降低。

3 结论

利用响应面分析法对β－淀粉酶抑制小麦淀粉回生工艺进行了优化。建立了相应的数学模型为以后的中试以及工业化生产提供理论基础，并且得到了酶处理的最佳工艺条件为:酶浓度34.33 U，酶作用温度为56.5℃，酶作用时间32.2 min，在此条件下测得小麦淀粉凝胶硬度相对于未经酶处理的小麦淀粉凝胶硬度降低了66.15%。测定酶处理前后小麦淀粉中直链淀粉和还原糖含量以及支链淀粉平均侧链长度，发现经β－淀粉酶处理后小麦淀粉中直链淀粉含量显著性降低，由酶处理前的25.40 g/100 g，减少到21.80 g/100 g;还原糖含量显著性升高，由酶处理前的 0.30 g/100 g，增加到8.10 g/100 g，直链淀粉和支链淀粉分子质量和分子长度显著降低，支链淀粉侧链长度降低。因此，得出β－淀粉酶抑制小麦淀粉凝胶回生的主要原因是β－淀粉酶作用小麦淀粉中直链淀粉与支链淀粉，以麦芽糖为单位水解直链淀粉和支链淀粉，从而降低了淀粉分子链长，降低了其形成双螺旋的趋向，抑制了淀粉的回生。酶作用过程中产生的麦芽糖也可能对于小麦淀粉凝胶回生亦可能起到了一定的作用。

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