多年宿根甘蔗根系及根际土壤AM真菌分析

陈廷速，卢文祥，韦勤丽，黄玉溢，张金莲 ，李 松，王伦旺，汪 茜 ，谭裕模，谭宏伟

（1.广西农业科学院微生物研究所，南宁 530007；2.广西柳城县甘蔗研究中心，柳城545200；3.广西农业科学院资源与环境研究所，南宁 530007；4.广西甘蔗研究所，南宁 530007；）

丛枝菌根（arbuscular mycorrhizae，AM）真菌是一类广泛分布于土壤中的有益微生物，能够侵染80%以上的陆生植物。AM真菌在提高植物对土壤水分、矿质营养（尤其是P）的吸收，增强其对多种生物胁迫和非生物胁迫（如干旱）的抗性，维持植物多样性和土壤生态系统的稳定性都发挥作用［1－2］。通过菌根和根际微生物来改善土壤生态，促进植物的生长，降低化肥的施用量，减缓对环境的污染，已成为农业可持续发展研究的热点之一。

甘蔗是我国重要的糖料作物，80%左右种植在旱坡地，由于多年的连作和过度依赖化肥来提高产量，已经普遍引起土壤恶化，土壤微生物群落失衡。甘蔗根际土壤具有丰富的AM真菌资源［3］，但甘蔗根系和根际土壤中的AM真菌群落结构尚未见报导。本文利用Nested PCR技术对有多年宿根的甘蔗根系及根际土壤的AM真菌群落结构进行分析，为深入开展甘蔗AM真菌的基础研究及AM菌剂在甘蔗大田上的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

2013年1月16日从广西柳城县甘蔗研究中心试验基地采集有6年宿根年限甘蔗 （品种为柳城0348，亲本来源：CP72-1210×ROC22）的甘蔗根系及根际土壤。按照甘蔗根际土壤采集方法[3]，采集10～20 cm土层土样约2 kg，同时收集植株的根系。将土样于阴凉处自然风干后，置于阴凉处保存备用。根样洗净后，置于-80℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 根样DNA的提取 参考董秀丽等[4]方法，并略修改。取洗净的根样1～2 g，剪成0.5 cm长的碎段，用超纯水漂洗3次，TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）漂洗1次，将其放入无菌的2 mL离心管中，加入500 μL TE缓冲液，沸水浴10 min，冰浴5 min，12000 r/min离心5 min，吸取上清液到新的离心管中，置于-20℃保存，备用。

1.2.2 土样 DNA的提取 用试剂盒：FastDNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals）（Catalog#6560-200）提取土样DNA，置于-20℃保存，备用。

1.2.3 Nested-PCR 将土壤DNA直接作模板,根样DNA稀释100倍后作模板，进行PCR扩增（eppendorf AG 6325）。 PCR所使用的引物为 ：GeoA2：5'-CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3'；Geo11：5'-ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC -3'；NS31 -GC：5'-TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC -3'；AM1：5'-GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA-3'；Glol：5'-GCCTGCTTTAAACACTCTA-3'[5-9]。 PCR 反应参考龙良鲲等[10]。

第一次PCR：所用引物为真菌18S rDNA通用引物GeoA2和Geo11。反应体系总体积为25 μL，其中2×Reaction Mix 12.5 μL （Golden Easy PCR System，TIANGEN），Golden DNA Polymerase （2.5 U/μL）0.2 μL，GeoA2（10 μmol/L）1.0 μL，Geo11（10 μmol/L）1.0 μL，模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL。 反应程序为：预变性94℃ 4 min；94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，30 个循环；72℃ 7 min。 第二次 PCR： 将第一次 PCR 产物 1∶100稀释后作模板进行，所用引物为NS31-GC和AM1，反应体系同上。反应程序为：预变性94℃2 min；94℃45 s，65℃ 1 min，72℃ 45 s，30 个循环；72℃ 7 min。 第三次 PCR：将第二次 PCR 产物 1∶100稀释后作模板进行，所用引物为NS31-GC和Glol，反应体系总体积为50 μL。反应程序为：预变性94℃ 2 min；94℃ 45 s，55℃1 min，72℃ 45 s，30 个循环；72℃ 7 min。

取PCR产物各5 μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测 （DYY-7C型电泳仪，北京六一仪器厂），在Alpha Innotech/Fluor Chem SP成像系统观察。

1.2.4 DGGE分析 取以根系及土壤DNA为模板，以NS31-GC/Glol为引物的PCR产物45μL，用基因突变检测系统（Bio-Rad公司）进行DGGE分析，胶浓度为8%的丙烯酰胺（丙烯酰胺︰双丙烯酰胺=37.5∶1），变性剂范围为20%～50%（100%的变性剂为40%甲酰胺，7M尿素）。电泳：150 V，4 h。染色：用SYBR Green染色（遮光）45 min后，在Alpha Innotech/Fluor Chem SP成像系统下观察。

图1 Nested PCR扩增

图2 根系及土壤的DGGE图谱

2 结果与分析

2.1 Nested PCR

通过第一次PCR产物，在土壤样品中检测到一条目标带，但不清晰，从根系扩增产物中未检测到目标带。第二次PCR，从土壤样品中得到大量的目标产物（0.55 kb），但在根系样品扩增产物中仍未检测到目标产物。根系和土壤的第三次PCR产物中，都检测到目标产物（0.23 kb）（图 1）。

2.2 DGGE分析

取土壤和根系样品的第三次Nested PCR产物，进行DGGE分析，结果出现21条带（图2）。土壤和根系样品的DGGE谱带具有明显差异，土壤样品中出现19条带，而根系仅仅出现6条带，两者相同的带数有4条 （S9/R1、S10/R2、S14/R3 和 S15/R4）， 其中土壤样品的特有条带为 S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S11、S12、S13、S16、S17、S18和S19，根系样品的特有条带为R5和R6。表明在这块6年宿根甘蔗的土壤中，AM种群较多，根系和土壤有4种相同的AM菌种群结构。

3 讨论

丛枝菌根真菌能与陆地上的80%以上植物共生，并能促进植物生长。不同种类的AM真菌可同时出现在同种植物的根系中，但不同种属的AM真菌菌丝差异却很难区别，因此，对AM真菌的鉴定在一定程度上限制了对土壤及根系中AM真菌群落结构的研究。已经有160种AM真菌根据孢子的形态结构进行鉴定（http://invam.caf.wvu.edu）。然而，在自然界，即使是同一种AM真菌的孢子，其形态结构也存在差异，另外，许多AM真菌也没有孢子[11]。因此，利用分子生物学技术研究田间AM真菌群落结构非常必要。

DGGE技术近年来广泛应用于微生物生态学研究领域。由于Nested PCR对AM真菌DNA进行特异性扩增，能从微量DNA中扩增出目标片段。为了从根系和土壤中获得特异性的AM真菌片段，本研究共进行了3次PCR，在第二次PCR中，以AM真菌特异性引物AM1将AM真菌DNA的特异片段进行扩增。在本DGGE结果中，根系和土壤样品中都有多条带出现，说明引物NS31-GC/Glol能在一定范围内对AM真菌的群落结构进行分析。本研究用的实验材料来源于具有6年宿根的甘蔗根际土壤，由于6年来一直没有施用任何肥料包括化肥，但产量一直在90t/hm2；土壤样品的理化性质：全氮0.105%，全磷0.067%，全钾0.854%，速效氮98 mg/kg，速效磷33 mg/kg，速效钾212 mg/kg，有机质20.6 g/kg，pH7.02。由于土壤生态条件好，因此，AM真菌群落构成极丰富，在根际及土壤样品中，总共扩增出21条特异性的目标片段。这和龙良鲲等[10]利用酸性土壤的根系、根际土壤及孢子做的分析得到的9条特异性的目标片段，具有极大的差异。

土壤样品中出现的DGGE条带数多于根系样品中的条带数，另有2条带仅出现在根系中。由于土壤中提取的AM真菌DNA只能来源于外生菌丝和孢子，孢子可以长时间存活在土壤中，而外生菌丝仅能存活5～6 d[12]，因此，某菌种产生较多的孢子，则土样中该菌种的条带就很强，反之则很弱[10]。根系样品有2条带在土壤样品中没出现，可能是这种AM真菌无孢子产生，且外生菌丝很少。总之，实验样品有丰富的AM真菌群落结构，详细的种群构成有待进一步的分析。

致谢：本研究得到厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心和福建农业科学院农业遗传工程重点实验室提供的帮助，深表感谢！同时感谢广西农业科学院李杨瑞教授和杨荣仲研究员的帮助！

[1]刘润进，陈应龙.菌根学[M].北京：科学出版社，2007.

[2]Gosling P,Hodge A,Goodlass G,Bending GD.Abuscular mycorrhizal fungi and organic farming[J].Agric Ecosyst Environ,2006,113:17-35.

[3]陈廷速，张金莲，李松，等.广西东南沿海甘蔗根际土壤AM真菌多样性研究[J].南方农业学报，2012，42（1）:57-61.

[4]董秀丽，赵斌.嵌套多重PCR-研究田间植物部分丛枝菌根真菌和微生物区系的一个可行技术[J].中国科学，2006，36（1）：59-65.

[5]Schwarzott D,Schüβler A.A simple and reliable method for ssuRNA gene DNA extraction,amplification and cloning from single AM fungal spore[J].Mycorrhiza,2001,10:203-207.

[6]Simon L,Lalonde M,Bruns TD.Specific amplification of 18S fungal ribosomal genes from vesicular-arbuscular mycorrhizal fungal communities[J].Applied and Environmental Microbiology,1992,58(1):291-295.

[7]Helgason T,Daniell TJ,Husband R,Fitter AH,Yong JPW.Ploughing up the word-wide-web?[J].Nature,1998,394:431.

[8]Cornejo P,Azco′n-Aguilar C,Barea JM,Ferrel N.Temporal temperature gradient gel electrophoresis(TTGE)as a tool for the characterization of arbuscular mycorrhizal fungi[J].FEMS Microbiology Letters,2004,241(2):265-270.

[9]Saito K,Nishiwaki A,Sugawara K.DNA extraction from arbuscular mycorrhizal roots of Miscanthus sinensis Anderss collected in the native grassland[J].Grassland Science,2000,46(2):182-184.

[10]龙良鲲，羊宋贞，姚青，朱红惠.AM真菌DNA的提取与PCR-DGGE分析[J].菌物学报，2005，24（4）:564-569.

[11]Helgason T,Merryweather JW,Denison J,Wilson P,Young JPW,Fitter AH.Selectivity and functional diversity in arbuscular mycorrhizas of co-occurring fungi and plants from a temperate deciduous woodland[J].J Ecol,2002,90(2):371-384.

[12]Staddon PL,Ramsey CB,Ostle N,Ineson P,Fitter AH.Rapid turnover of hyphae of mycorrhizal fungi determined by AMS microanalysis of 14C[J].Science,2003(5622),300:1138-1140.