兔肺VX2鳞癌移植瘤射频消融后残存肿瘤ERCC1表达的变化

马连君 周乃康 祁彦君 刘慧峰 赵亚超 郑梦利

射频消融（radiofrequency ablation, RAF）是通过射频电流引起离子振荡和极性生物大分子极性转换，造成摩擦，使靶区组织升温，导致凝固性坏死的一种局部热损毁手段，具有操作方便、创伤小、恢复快的特点[1]。在胸部恶性肿瘤领域，RFA主要用于不能耐受手术的早期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和肺内转移肿瘤的治疗[2]。随着RFA应用的普及，人们发现残存肿瘤细胞是影响其远期疗效的最主要因素[3,4]，RFA联合铂类药物化疗是减少术后肿瘤细胞残存的有效手段之一，但在具体的结合模式方面，尚缺乏统一认识[5,6]。近年来，人们对RFA治疗后残存肿瘤细胞的一些生物学特性改变进行了深入研究[7-10]。ERCC1表达情况常用作肺癌对铂类化疗药物敏感性的预测指标，也用作肺癌患者预后指标[11]，目前尚无肺肿瘤RFA治疗后残存肿瘤细胞ERCC1表达情况的研究报道。兔VX2肿瘤源于Shop病毒诱导的兔乳头状瘤衍生鳞癌，有高侵袭性和高转移性，可在多种兔子、多种脏器建立移植瘤模型[12]。为此，我们采用免疫组织化学方法对RFA治疗后兔肺内残存VX2鳞癌细胞ERCC1表达情况进行了研究。

1 材料与方法

1.1 荷瘤动物模型制备和分组 70只健康纯种新西兰白兔，3月-4月龄，体重2.0 kg-2.5 kg，雌雄不限（由解放军总医院实验动物中心提供）；肌肉注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后，右胸壁脱毛，采用组织块悬液肺内注射法[12]建立VX2鳞癌肺内移植瘤模型（VX2鳞癌细胞株由解放军总医院肿瘤中心提供）；然后随机分为对照组10只，RFA组60只。RFA组再按时间分为0 d（即时）、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d共6个组，每组10只。

1.2 RFA治疗和取材 待新西兰白兔肺内VX2鳞癌生长至最大径超过10 mm后进行RFA治疗。以前述方法麻醉，3 mm层厚连续胸部CT扫描定位，置入10针集束电极，确认其尖端位于肿瘤中心后，控制电极展开直径不超过8 mm。开启RF2000型射频机（RadiotherapeuticTM公司生产），起始输出功率为30 W，每分钟升高10 W，最高输出功率60 W，治疗4 min，退出电极。CT扫描有无血、气胸发生，并及时进行胸腔穿刺治疗。术后常规饲养，并肌肉注射青霉素160万单位/天（0 d-3 d）。各RFA组实验动物按相应时间点处死，取凝固性坏死边界内外各3 mm的肿瘤组织，4%中性甲醛固定后，常规制备石蜡切片，HE染色观察，以同时含有凝固性坏死肿瘤和残存肿瘤的组织为合格标本，否则为不合格标本。对照组实验动物仅置入并展开电极，不进行RFA治疗即处死，取周边的肿瘤组织作为研究标本。

1.3 免疫组织化学染色 对照组和RFA组合格标本的石蜡块连续4 μm厚切片，按Envision法进行免疫组织化学染色。即用型鼠抗兔ERCC1单克隆抗体（克隆号：8F1）及免疫组织化学检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，实验步骤按试剂盒说明书进行。以提供的阳性切片在同一条件下染色作为阳性对照，用PBS替代一抗作为阴性对照。利用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，以细胞核内发现棕黄色颗粒为阳性，每例标本在400倍光镜下选取5个有代表性的区域进行计数，共计数500个-1,500个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分率。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行数据分析，肿瘤细胞ERCC1表达的阳性百分率采用Mean±SD表示，各RFA组均同对照组进行比较，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义，检验和P值均为双侧。

2 结果

2.1 合格标本数量 RFA组共获得48例合格标本。在12例不合格标本中，7例因为实验动物死于RFA并发症未达相应时间点而剔除（大量气胸2例，大量血胸1例，广泛肺不张4例）；其余5例因HE染色未见残存肿瘤细胞，不符合本实验要求而剔除。

2.2 残存肿瘤的分布 对RFA组合格标本HE染色观察发现，绝大多数残存VX2鳞癌细胞位于凝固性坏死灶周边，成片存在（图1）；在凝固性坏死灶内较大血管周围偶见残存肿瘤细胞；凝固性坏死灶的其它区域未见残存肿瘤细胞。

2.3 ERCC1免疫组织化学染色结果 对照组肿瘤细胞以及RFA组残存肿瘤细胞均见ERCC1表达（图2），而凝固性坏死的肿瘤细胞未见ERCC1表达。对照组（n=10）肿瘤细胞ERCC1表达阳性率为32.9%±2.5%；1 d（n=7）、3 d（n=6）、5 d（n=8）组残存肿瘤细胞的ERCC1表达阳性率分别为50.7%±1.4%、53.7%±1.6%和36.9%±2.5%，明显高于对照组（P＜0.05），尤其以3 d组最高（t=18.23, P＜0.001）；而0 d（n=9）、7 d（n=10）、14 d（n=8）组的残存肿瘤细胞ERCC1表达阳性率分别为31%±2.1%、33.7%±1.4%和32.8%±1.4%，同对照组比较无明显差异（P＞0.05）。

3 讨论

图 1 兔肺内VX2鳞癌RFA治疗后的残存肿瘤细胞和凝固性坏死肿瘤细胞（HE,×100）。白色箭头：凝固性坏死的肿瘤细胞；黑色箭头：残存肿瘤细胞。Fig 1 Residual cells and coagulation necrosis cells of VX2 squamous carcinoma in rabbit lung after RFA (HE, ×100). Black arrows: residual cells; White arrows: coagulation necrosis cells. RFA: radiofrequency ablation.

肺内肿瘤RFA治疗效果同肺的组织学特点密切相关。由于大量气体的存在，导致肺内电传导和热传导的效应远低于其它实质性脏器；另外，在肺肿瘤周边持续存在的血流、气流又造成明显的“散热效应”。这两种因素导致RFA靶区周边以及靶区内部较大血管周围容易形成肿瘤残存[13]。虽然，近年通过改良电极等手段扩大了消融范围，但残存肿瘤问题仍没有得到根本解决[4]，肺内恶性肿瘤RFA治疗后残存肿瘤发生率为12%-40%[1]。在本研究中，我们通过控制电极展开范围、输出功率和治疗时间的方法，建立了兔VX2鳞癌肺移植瘤RFA治疗后的残存肿瘤模型。通过HE染色观察发现，这种模型的残存肿瘤细胞大多位于凝固性坏死灶的周围，在较大血管周围发现少量的残存肿瘤细胞，这一结果同其它文献报道[1,4,13,14]相吻合。采用这种方法建立的兔肺内肿瘤RFA后残存肿瘤模型，方法简单、安全，成功率高，能够很好的模拟RFA后肺内残存肿瘤的实际状态，为相关研究提供了合适的平台。

图 2 RFA治疗后兔肺内残存VX2鳞癌细胞ERCC1的表达 (IHC, ×400)Fig 2 ERCC1 expression of in residual VX2 squamous carcinoma cells in rabbit lung after RFA (IHC, ×400)

RFA治疗后残存肿瘤对于肺肿瘤患者远期生存率的影响很大。von Meyenfeldt等[14]报道肺转移瘤患者RFA治疗后有肿瘤残存者3年生存率为49%，而无肿瘤残存者3年生存率为79%。近年来，人们尝试联合含铂类药物化疗，以减少RFA治疗后残存肿瘤细胞，提高治疗效果，但是在铂类药物给药时机方面尚缺乏统一的认识[5,6]。铂类药物通过造成DNA链间交联引发的一系列反应最终导致细胞死亡，这种DNA链间交联可以被细胞内的核酸切除修复（nucleotide excision repair, NER）机制清除，从而修复铂类药物造成的DNA损伤，消弱其细胞毒性，导致耐药。ERCC1是NER的限速酶，是公认的反映NER功能的生物标记物，临床上常作为判断肿瘤细胞对铂类药物敏感性的标志物使用[11]。Olaussen等[15]经对761例NSCLC手术标本的ERCC1表达分析，发现术后含铂类药物化疗能延长ERCC1低表达患者的生存，但对于ERCC1高表达的患者无益处；并且ERCC1高表达可能意味着对铂类耐药。另一方面，ERCC1表达情况与NSCLC患者的预后也密切相关[16,17]，ERCC1高表达的患者预后好于ERCC1低表达的患者，其原因是ERCC1低表达提示NER功能低下，容易导致DNA损伤积累增加，故患者预后差；而ERCC1高表达则相反。近期的一些研究[7-10]发现RFA治疗后残存肿瘤细胞的增殖、侵袭以及转移能力发生了改变，但关于ERCC1表达变化的研究尚未见报道。本研究采用免疫组织化学方法检测了RFA治疗后兔肺内VX2鳞癌残存肿瘤细胞ERCC1表达，结果显示在RFA治疗后1 d-5 d内残存肿瘤细胞ERCC1表达明显高于对照组水平，5 d后降至对照组水平。这一现象提示肺内残存的VX2鳞癌细胞受亚致死性热损伤后NER功能增强，这可能是一种自身保护性反应[18]，但这种反应的可能导致铂类药物的细胞毒性下降，影响化疗效果。结合Olaussen等[15]的研究结果，我们认为在RFA治疗后5 d内给予铂类药物化疗，可能效果不佳。另外，因在RFA治疗5 d后兔肺内残存VX2鳞癌细胞ERCC1表达阳性率降至对照组水平，故从判断预后角度看，无明显影响。

本研究仅是在动物模型上进行的肺内肿瘤RFA治疗后残存肿瘤ERCC1表达改变的初步探索，对于判断RFA治疗后铂类药物化疗时机还存在一定的局限性和不足之处。肺内肿瘤有多种细胞类型，而本研究仅为一种肿瘤细胞的实验结果，故有待其它类型肿瘤细胞表达数据及临床治疗研究的佐证。另外，影响铂类药物化疗效果的因素还有很多，比如RFA治疗后残存肿瘤细胞的细胞周期改变、肿瘤局部血液供应改变等，故在这些方面还需要深入研究。