温脾通络开窍法对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及海马Tau蛋白磷酸化表达的影响1）

吴 林，杨进平，温惠娟，王青碧，蔡鑫昆，毕信亚，麻小梅，赵海涛

阿尔茨海默病（AD）又称老年性痴呆，是一种以进行性记忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病[1]。AD发病机制极其复杂，病因学尚不清楚，其典型的病理特征是老年斑（SP）形成、神经纤维缠结（NFT）及胆碱能神经元的变性、坏死。其中，NFT的数量和患者的痴呆程度呈明显的正相关，被认为是AD患者的神经元退化的病理基础[2]，是AD的核心病理改变。NFT的主要成分是由异常过度磷酸化的Tau蛋白聚集而形成的双螺旋（PHFs）。

本实验首先应用脑立体定位技术向大鼠右侧海马注射冈田酸建立AD大鼠动物模型，采用经典的Morris水迷宫实验，对AD大鼠动物模型进行筛选并观察温脾通络开窍法对AD大鼠学习记忆障碍的改善作用，以及采用蛋白免疫印迹法检测AD大鼠海马组织Tau蛋白磷酸化总量，旨在进一步探讨温脾通络开窍汤抗AD的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3月龄，SPF级雄性SD大鼠60只，体重200g±20 g，由广西医科大学动物中心提供（编号：SCXK2007－0002）。

1.2 实验药物 温脾通络开窍方（黄芪30g，益智仁10g，三七10g，石菖蒲10g，何首乌10g，绞股蓝10g），由江苏江阴天江药业有限公司提供中药配方颗粒；石杉碱甲，浙江震元制药有限公司生产（批号：120303）。

1.3 实验试剂 冈田酸（OA），Sigma公司生产（批号：04511）；二甲亚砜（DMSO），Amresco公司生产（批号：0231）；兔抗大鼠磷酸化 Tau抗体（PHF－1，批号：ab32057）购自 Abcam 公司；HRP标记羊抗兔二抗、BCA蛋白浓度检测试剂盒、免疫印迹化学发光试剂、蛋白提取试剂盒、预染的蛋白Marker、PVDF膜购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.4 主要器材和设备 脑立体定位仪（ST－3ND型脑立体定位），成都仪器厂生产；Morris水迷宫设备全套（包括 Morris水迷宫，电脑摄像系统，配套软件分析系统），北京中科院生理所生产；Bio－Rad垂直板式电泳槽仪，美国；DSCT－200数码相机（日本SONY）。

1.5 方法

1.5.1 造模方法 60只SD大鼠适应性喂养1周，大鼠经10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉后，固定于大鼠脑立体定位仪上。手术器械均消毒，常规皮肤消毒，无菌操作。52只大鼠实施OA右侧的海马CA1区注射造模，另8只作为空白对照组。参照George等的《大鼠脑立体定向图谱》，选择右侧海马CA1区（前囟后3.6mm，中线旁开2.4mm，颅骨表面下2.7mm），为注射靶区。用特制三棱针手动钻颅骨至一定深度，再用微量进样器旋转钻动至微有落空感，随后自头皮表面垂直进针4.0 mm（微量进样器注射钢针外套一次性介入导管并固定，针尖留出4.0mm），将溶于10%DMSO的 OA 1.5μL（0.4mmol／L）缓慢（10min）注入，留针15min以保证药液充分弥散，然后缓慢拔出针。空白组大鼠于相同部位注射等体积的10%DMSO。间隔2d后以相同的方法再注射1次。所有大鼠术后伤口均涂适量红霉素软膏，术后腹腔注射青霉素钠每只80 000U，以防感染。

1.5.2 Morris水迷宫的制作及实验方法 MWM参照相关文献制作[3]，水迷宫置于房间的中央，为一圆形不锈钢水池，直径200cm，高50cm，水深30cm。水池内壁被漆为黑色，池水用黑炭墨均匀的染成黑色，水温保持在（22±1）℃。将水池等分为4个象限，即第一、第二、第三、第四象限，在第三象限中心放置一黑色平台，平台为圆形，直径11cm，平台高28cm（即平台低于水面2cm，称隐藏平台）。水迷宫正上方2m高处装有一个小型摄像机，并与另一房间的录像机和监视器连接，记录大鼠的逃避潜伏期及跨越平台次数。MWM实验共进行4.5d，实验方法如下。

1.5.2.1 定位航行实验 共进行4.5d，每天分上下午2个时间段，每个时间段每只大鼠训练4次。每次均随机顺序从不同等分水池的4个起点将大鼠面向池壁放入池中（大鼠头向上，以防溺水），记录其60s内成功进驻平台（大鼠找到平台并滞留其上5s为成功）所需时间（即逃避潜伏期）。如在60s内大鼠不能成功进驻平台，则将其引上平台并令其停留10s，记录逃避潜伏期为60s，每次训练间隔时间为60s。每一时间段内4次潜伏期的算术均数作为这一时间段的成绩。

1.5.2.2 空间探索实验 实验最后半天撤除平台，从第一象限池壁中点将大鼠放入水中，记录2min内大鼠跨越第三象限平台次数。

1.5.3 AD模型筛选 造模14d后进行AD模型筛选，按照上述定位航行实验方法，参照赵宪林等[4]的AD大鼠模型筛选标准进行筛选，即以空白组大鼠逃避时间的均值为参考值，计算模型组大鼠各时段成绩的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比例，该值＞20%定为AD大鼠。造模组大鼠痴呆个数占造模组大鼠总数的比率为造模成功率。造模2周内造模组大鼠死亡4只，空白组死亡1只。经过筛选，造模组48只大鼠符合上述要求的大鼠40只进行后续实验，造模成功率为76.9%。

1.5.4 分组及给药剂量 将造模成功的模型组大鼠40只随机分为温脾通络开窍汤高、中、低剂量组，西药对照组，模型组。每组8只AD模型大鼠。空白对照组7只。造模第20天开始灌胃给药，给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定，以临床人用药等效剂量作为中剂量，中药高、中、低剂量组大鼠的给药剂量分别为4.15g／kg、8.3g／kg、16.9g／kg，西药组给药剂量为3 mg／kg。模型组及空白对照组均予相应体积的双蒸水灌胃。各组大鼠按剂量每天灌胃给药一次，共21d。治疗期间，模型组、中药低剂量组、中药中剂量组各死亡2只，西药组、中药高剂量组各死亡1只。

1.5.5 取材 各组AD大鼠治疗21d后进行水迷宫实验，待水迷宫实验后，在冰台上采取心脏灌注断头取脑，迅速分离右侧海马组织放入－80℃冰箱冻存。

1.5.6 Western－blot检测大鼠海马Tau蛋白异常磷酸化

1.5.6.1 组织蛋白提取 ①从冻存的－80℃冰箱里取50mg海马组织，尽量将其剪碎；②将剪碎的组织块放入匀浆器中，加入含有PMSF的缓冲液400μL，然后置于冰块上匀浆；③在恒温4℃下15 000r／min离心5min，再取上清液分装在0.5mL冻存管中并放入－20℃冰箱保存备用。

1.5.6.2 Tau蛋白含量的测定 ①取1.5mL离心管，每管加入考马斯亮蓝溶液（4℃储存）1mL。在室温下放置30min后备用。②取一管考马斯亮蓝加0.15mol／L NaCl溶液100μL，混匀后放置2min，用于检测空白样品。③取一管考马斯亮蓝加入95μL 0.15mol／L NaCl溶液和5μL待测蛋白样品，混匀后静置2min，再进行检测。

1.5.6.3 SDS－PAGE凝胶电泳 ①安装玻璃板。②加入TEMED后立即摇匀即可凝胶。灌10%分离胶时，用10mL枪头吸取5mL胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度。在分离胶上覆盖一层水，以隔绝空气。③待水和凝胶之间出现一条清晰的线条时，倒去水并用吸水纸将水吸干。④加入TEMED后立即摇匀灌胶。在剩余空间灌满4%浓缩胶，立即将梳子插入浓缩胶中。室温垂直静置，等待凝胶聚合。⑤用水冲洗浓缩胶，将其放入电泳槽中。⑥加入已煮沸变性的蛋白样品，上样量一致。⑦在电泳槽中加入1X电泳缓冲液。电泳时间3 h左右，电压为40V。至溴酚蓝刚跑出则终止电泳。

1.5.6.4 转膜 ①切取6张大小与转印区域一样的滤纸，然后把它们浸泡在电转缓冲液中。切取同样大小的PVDF膜，置于有超纯水的平皿器里2h。②在PVDF膜上垫3张滤纸，将凝胶平铺其上，再放上3张滤纸，用玻璃棒在滤纸面上滚动除去各层气泡，然后放入电转仪内，用60V电转2h（注：在槽的一边放入一块冰来降温）。③转完后将膜用1X丽春红染液染5min。然后用水冲洗掉没染上的染液，再将膜晾干备用。

1.5.6.5 免疫反应 ①将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿器中，室温下在脱色摇床上摇动封闭1h。②倾去封闭液，加入用TBST稀释的一抗；室温下孵育1h左右后，在室温下，用TBST在脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBST洗1次，10min。③准备二抗稀释液并与膜接触，冲洗方法同上。

1.5.6.6 化学发光，显影，定影 ①将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移到另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X－光片夹中。②在暗室中用X胶片感片、显影及定影。③用凝胶图像分析将胶片进行拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

2 结 果

2.1 一般行为观察 向已完全麻醉的大鼠右侧海马注射OA 5 h后，大部分大鼠苏醒，8h后大鼠能全部苏醒，本实验未见有麻醉过量而死亡的大鼠。苏醒后大鼠静卧或能稍活动，有的甚至可以进食。在未进行AD大鼠筛选前，空白组大鼠较模型组大鼠表现活跃些，模型组大鼠绝大多数表现懒散少动，喜静卧在鼠笼暗区，敲打鼠笼大多数只是睁眼，轻微动弹一下，而空白组大多数大鼠会睁眼张望，甚至起身走动。经过3周治疗后，观察到中药高、中剂量组，西药组和正常组大鼠反应比较敏捷，一有动静即睁眼，跑到栅栏张望，对气味也比较敏感，实验人员取带香味的食物置笼边，大鼠立即跑来，鼻腔作嗅物状，而低剂量组和模型组大鼠绝大多数在原地不动，只是稍许睁眼，反应迟钝。

2.2 定位航行试验 模型组潜伏期5d内的变化较缓慢，无明显缩短。各治疗组潜伏期随着训练天数的增加而明显缩短，且各中药组逃避潜伏期之间存在一定递减关系。模型组平均潜伏期比空白组明显延长（P＜0.01）。西药组和高、中、低剂量组平均潜伏期较模型组明显缩短（P＜0.01）。高剂量组与西药组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。中、高剂量组差异有统计学意义（P＜0.01）。模型组大鼠学习记忆行为能力明显受损，而温脾通络开窍汤对AD模型大鼠有一定程度的保护作用，并且中药各组之间存在一定的量效关系。

2.3 空间探索试验 模型组较空白组大鼠成功找到平台的次数明显下降（P＜0.01）。中药组与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。西药组与高、中剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），与低剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05），高剂量组与中剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 各组学习成绩比较（±s）

表1 各组学习成绩比较（±s）

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2.4 各组大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白含量比较 模型组与空白组比较含量显著增加（P＜0.01），低量组、西药组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05），中药高、中剂量组与模型组比较显著降低（P＜0.05或P＜0.01），与西药组比较差异有统计学意义（P＜0.01），但中药高、中剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

表2 各组大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白的表达（±s）

表2 各组大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白的表达（±s）

组别 剂量 n PHF－1空白组 生理盐水 7 20.48±5.12模型组 生理盐水 6 50.14±9.241）西药组 3mg／（kg·d） 7 45.35±8.21高剂量组 16.9mg／（kg·d） 7 28.13±6.833）4）中剂量组 8.3mg／（kg·d） 6 36.15±7.212）4）低剂量组 4.15mg／（kg·d） 6 42.25±7.68与空白组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05；3）P＜0.01；与西药组比较，4）P＜0.05

3 讨 论

Tau蛋白是一种能促使微管装配的微管相关蛋白，由于以磷酸化和糖基化为主的Tau蛋白异常翻译后修饰与神经原纤维缠结关系密切[3]，Tau蛋白的异常过度磷酸化可能是神经元纤维退变的早期病理表现。因此，对于Tau的研究已经成为近年AD研究领域的一大热点。近年来研究显示，Tau蛋白的异常过度磷酸化不仅使其丧失催化微管装配和稳定微管结构的正常生物活性，还使其变成具有细胞毒性的分子，导致神经元纤维的形态异常和轴浆转运障碍[5]，并促使其自身沉积为NFT，还可猎获正常的微管相关蛋白，使微管崩解、轴突变性、细胞退化及丢失，最终导致AD患者的认知功能受到严重的损害。

从实验结果中可以看出，冈田酸诱导的AD模型大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白总量增加，经过温脾通络开窍方治疗后，中药组AD模型大鼠海马组织磷酸化Tau蛋白总量均有不同程度的下降，其中以中药高、中剂量作用明显，可见中药组之间存在一定的量效关系，当温脾通络开窍方达到一定剂量时对磷酸化的Tau蛋白的抑制作用显著。有关体外研究表明[6]当Tau蛋白异常磷酸化后，释放出的Tau蛋白重新恢复其促微管的活力，而温脾通络开窍方恰能降低异常磷酸化的Tau蛋白水平，使其去磷酸化增多，这有可能逆转了AD的神经纤维缠结的病理改变。

老年性痴呆属中医“善忘”、“痴呆”、“郁症”等范畴，与增龄密切相关。中医学认为心主神志，主持人的精神、意识、思维及情感活动，包括了现代医学中枢神经系统的大部分功能在内。现代医学将本病定位于脑，即是定位于中医学之心。痰生于脾，而神由心主，痰必先蒙心窍，而后心神昏聩发为健忘、痴呆。因此本病发病机制主要在心脾两脏。

痰浊的产生是衰老过程中的重要变化之一，是加速衰老的基本病理因素。“脾为生痰之源”，脾失健运，水湿不化，聚而为痰。痰之所生，当责之于脾。清代陈士铎在《辨证录·呆病门》中论及本病形成时说“起于肝气之郁；其终也，由于胃气之衰”。认为脾胃虚弱，运化不足为本病痰浊生成的关键之一，而“痰势最盛，呆气最深”，则进一步强调了痴呆程度与痰浊的关系。在治疗方法中也谈到“治呆无奇法，治痰即治呆”，认为温脾化痰开窍是本病治本之法。

中医素有“老人多瘀”、“久病必瘀”之说。人至老年，脾气不足，气化无源，推动无力，气不行血，血流失畅，郁于心络乃成血瘀。另一方面，痰浊蒙心，痰瘀相关，亦可加重血行不畅。唐容川在《血证论》中指出：“凡心有瘀血，亦令健忘……血在上则浊蔽而不明矣。凡失血家猝得健忘者，每有瘀血”。说明瘀血痹阻心络是本病又一重要病理基础。

中医学自古即肾虚、脾虚并存，其治有补肾、补脾之争。生命既始，先天之源概止，性命全赖水谷之养。脾气运化，化生水谷精微，其气升清，将水谷之精上输于心肺，维持心神及全身生命活动。若脾亏气化不行，谷精不得布散，积而为痰成瘀；痰蒙清窍，瘀阻心络，心神失养，发为健忘、痴呆。肾为先天之本，脾为后天之本。老年人脾气既亏，纳减运弱，化源不足，先天失充则肾精化生乏源，肾虚髓减。肾气不足则志气衰，不能上通于心，故迷惑善忘也。所以现代所用补肾填精方药治疗此病也能收到一定的疗效。但是在本病发病过程中，脾虚为本，故填精补血之法并不能取得令人十分满意的疗效。总之，AD早期以脾虚为本，痰蒙心窍，心络不畅，心神失常为发病关键，至后期痰瘀痹阻，胶着不解，心窍闭塞，脾肾两亏，迁延难愈。

针对AD病机演变过程中的关键环节，采用温脾通络开窍之法，拟定温脾通络开窍方进行中医药早期干预，以期在疾病早期控制病情，防止病情发展。方中黄芪性微温、味甘，归肺、脾经，功专补气升阳；益智仁性温，味辛，入脾、肾经，温脾暖肾，固气涩精；二药相须为用，益气补阳，温肾助脾，既资后天之源，又强运水化湿之功以绝痰浊之源，共为主药；益智仁复取其益火补土之意，温肾阳以助脾阳。三七性温，味甘、微苦，归肝、胃经，通络活血；石菖蒲性温，味辛、苦，入心、脾、肝经，和中祛湿辟浊，豁痰开窍醒神；三七配黄芪，可加强通络之力，石菖蒲伍益智仁，又能醒脾助运，共为臣药。何首乌性微温，味苦、甘、涩，入肝、肾经，补肝肾，益精血，以补精血之不足。绞股蓝性寒，味甘、苦，归脾、肺经，温脾化痰，又因其性寒可防止温脾通络之药温燥伤阴之弊，共为佐使。诸药相合，补而不腻，温而不燥，既可温脾治本，又能通络祛痰除标，开窍醒神改善症状。

临床上以温脾通路开窍法[7，8]治疗AD患者疗效显著，从而也证实了AD以脾虚为本，痰蒙心窍，心络不畅，心神失常为发病关键，及至后期痰瘀痹阻，胶着不解，心窍闭塞，脾肾两亏，迁延难愈的病理演变过程。本实验的结果也反证了温脾通络开窍法防治AD的现代机制所在，其对AD大鼠学习记忆障碍具有明显的改善作用，且可降低AD大鼠海马Tau蛋白异常磷酸化水平，这也可能是其抗AD的作用机制之一。

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