平喘巴布剂药材的提取工艺研究

兰小群 叶秀波 黄雨威 王利胜

1.广东岭南职业技术学院，广东广州 510663；2.广东省广州市海珠区中医医院，广东广州 510220；3.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006

平喘巴布剂源于《张氏医通》，是由芥子、延胡索、甘遂、细辛等几味药材组成，具有利气祛痰散寒逐饮之效，多用于穴位敷贴防治哮喘，属于经皮给药系统，疗效确切，且在临床上具有广泛的应用基础[1-2]。在经皮给药制剂中，确保足够量的药物透过皮肤进入体内达到有效的血药浓度是关键，方中芥子、延胡索、甘遂、细辛的主要活性成分均适合于乙醇提取[3-6]，而芥子又为方中君药，主要含季铵盐生物碱芥子碱类成分，广泛存在于十字花科植物中，代表性分是芥子碱，多以硫氰酸盐形式存在，芥子碱硫氰酸盐（Sinapine thiocyanate，ST）具有镇咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗衰老、抗雄激素、降血压等多种生物活性[3-7]。因此本研究采用正交试验法，以芥子碱硫氰酸盐的提取率为指标，优选药材乙醇提取工艺，确定最佳提取条件，为平喘巴布剂体内外透皮吸收特性的研究奠定物质基础。

1 仪器与试药

1.1 药品与试剂

芥子碱硫氰酸盐对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111702-201002）；芥子、延胡索、甘遂、细辛等（广州致信中药饮片有限公司）；磷酸二氢钾、乙醇为分析纯；甲醇、乙腈为色谱纯；水为怡宝水。

1.2 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）；旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂）；KQ-500型超声清洗仪 （昆山市超声仪器有限公司）；AUW120D精密分析天平（日本岛津公司）。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件

色谱柱：迪马 Platisil ODS 柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），以Phenomenex为保护柱；流动相：乙腈-0.1 mol/L 的磷酸二氢钾=14∶86；检测波长：326 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：10 μL。 理论塔板数按芥子碱硫氰酸盐峰计算不低于3000。

2.1.2 溶液的配制

2.1.2.1 对照品溶液的配制 精密称取经五氧化二磷干燥至恒重的芥子碱硫氰酸盐对照品5.67 mg，于100 mL的容量瓶中，用流动相溶解制成56.7 μg/mL的对照品溶液。

2.1.2.2 对照药材溶液的制备 精密称取芥子对照药材细粉1.12 g，置具塞的锥形瓶中，加甲醇50 mL，超声（功率 250 W，频率 20 KHz）提取 3次，每次20 min，滤过，滤液减压回收溶剂至干，残渣用流动相溶解并转移至50 mL的容量瓶中，定容，再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.2.3 供试品溶液的制备 按照处方比例称取芥子、延胡索、细辛和甘遂，9份，分别按L9（34）正交试验表进行实验，每次提取后趁热过滤，药液用旋转蒸发仪浓缩至药材量1∶1的浓缩液，放至室温后，加水定量至20 mL。然后精密吸取1～9号提取液各0.2 mL，置10 mL的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得1～9号正交试验的供试品溶液。

2.1.2.4 阴性样品溶液的制备 按处方比例称取除芥子外的其他药材，与供试品溶液同法制备。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 线性范围考察 分别精密吸取上述芥子碱硫氰酸盐对照品溶液 2、6、10、15、20 μL 进样， 测定，以芥子碱硫氰酸盐峰面积积分值为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线，线性回归分析，得标准曲线方程：Y=3×106X-29 592，r=0.9999。 结果表明芥子碱硫氰酸盐进样量在0.1134～1.1340 μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.1.3.2 精密度试验 精密吸取芥子碱硫氰酸盐对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定，按芥子碱硫氰酸盐的峰面积积分值计算RSD为0.58%，表明该仪器具有良好的精密度。

2.1.3.3 稳定性试验 精密吸取正交试验5号供试品溶液 10 μL，分别于 0、2、4、8、12 h 进样，测定芥子碱硫氰酸盐峰面积，计算其RSD为1.08%，表明样品溶液在12 h内稳定。

2.1.3.4 重复性试验 取正交试验5号浓缩液，加水定容至 20 mL，再精密吸取 0.2 mL，5 份，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法，制备样品，分别进样10 μL，测定，计算芥子碱硫氰酸盐含量平均值为0.536%，RSD为1.06%。结果表明方法重复性良好。

2.1.3.5 加样回收率试验 精密吸取正交试验3号提取液0.2 mL，6份，分别加入芥子碱硫氰酸盐对照品溶液0.1、0.2和 0.4 mL，置 10 mL的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，再用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液为加样回收供试液，分别进样测定，计算回收率分别为 99.35%（RSD=2.73%），101.66%（RSD=2.13%），99.76%（RSD=1.86%）。 结果表明，该分析方法的回收率符合要求。

2.1.4 样品分析

分别精密吸取“2.1.2”项下的芥子对照药材溶液、阴性样品溶液、供试品溶液各10 μL，在上述色谱条件下，进样，分别平行测定两份，将平均芥子碱硫氰酸盐峰面积积分值代入线性方程，求各样品芥子碱硫氰酸盐的含量，计算芥子对照药材、1～9号正交试验样品中芥子碱硫氰酸盐提取率。

2.2 正交试验设计

根据各药材的性质，选用乙醇为提取溶媒，对该处方有效成分提取率有较大影响的四个因素：提取时间（A）、乙醇用量（B）、乙醇浓度（C）、提取次数（D），分别拟定3个水平，以芥子碱硫氰酸盐提取率（mg/g）为考察指标，选用L9（34）正交试验表进行优选，因素水平表见表1。

表1 因素与水平表

2.3 结果

2.3.1 各溶液色谱图

芥子碱硫氰酸盐对照品、正交实验样品、对照药材以及阴性对照溶液的高效液相色谱图见图1。由图1可见对照品、样品及对照药材中芥子碱硫氰酸盐的出峰时间基本一致，且峰形良好，无杂峰干扰，阴性对照溶液无干扰，表明所建立的方法具有较好的专属性，可用于平喘巴布剂提取工艺中芥子碱硫氰酸盐含量的测定。

2.3.2 芥子药材的含量测定

取本实验用药材1.12 g，3份，按照“2.1.2”项下对照药材溶液制备方法，制备样品溶液，精密吸取10 μL进样，测定，计算芥子碱硫氰酸盐的含量，换算成芥子中芥子碱硫氰酸盐的含量为0.73%，略高于《中国药典》2010年版规定，所以本批药材符合规定。

图1 芥子碱硫氰酸盐的高效液相色谱图

2.3.3 正交试验结果

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

由表2可知，极差分析各因素对药材提取率的影响顺序为：C＞A＞D＞B，经方差分析只有C因素有显著性影响，故应取最好值C2，A因素虽无显著性，但影响仅次于C因素，也可取最好值A2，D和B根据极差，可取有利于生产节约成本的次好水平B1D2，因此最佳工艺为A2B1C2D2，即6倍量70%的乙醇回流提取2次每次2 h。

2.4 优化工艺验证

为了考察上述优选出的提取工艺的稳定性，称取处方量各药材，3份，分别以6倍量70%的乙醇回流提取2次每次2 h，趁热滤过，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩至药材量1∶1的浓缩液，放至室温后，精密吸取提取液0.2 mL，置10 mL的容量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液10 μL进样，计算芥子碱硫氰酸盐的含量，结果芥子碱硫氰酸盐平均提取率为 8.58 mg/g，RSD为 0.83%，浸膏平均收率为15.86% ，RSD为1.36%。结果表明该工艺稳定可行，为后续的研究奠定了基础。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

曾采用水提醇沉和乙醇回流方法提取对比实验，结果表明乙醇回流法提取芥子碱硫氰酸盐提取率稍高一些，而浸膏收率相对较少，同时药材的合并提取还应该考虑到其他成分的影响，因此采用正交试验继续考察提取时间、乙醇用量、乙醇浓度、提取次数对提取率的影响，优选出了最佳的提取工艺，以保证能够提取到最大量的有效成分，为后面进行的平喘巴布剂体内外透皮吸收特性的研究奠定基础。

3.2 考察指标及测定方法的选择

芥子碱硫氰酸盐的HPLC法为《中国药典》2010年版[8]收载，以控制芥子药材的质量，因此本实验测定芥子碱硫氰酸盐的含量为考察指标，在一定程度上反映芥子有效成份的浓度，也为进一步的透皮吸收试验及制剂研究奠定了基础。芥子碱为季胺类生物碱，因而在弱酸性溶液中稳定，在碱性条件易分解为芥子酸和胆碱，故本实验在弱酸性条件下进行有利于被测成分的分离[9]。芥子碱硫氰酸盐的测定方法文献报道采用HPLC法较多，为了获得较好的峰形和分离效果，在流动相中加入3%醋酸，梯度洗脱[10-11]，或加入0.08 mol/L磷酸二氢钾[12]，本实验参考药典选择后者，并对流动相比例进行了适当调整，方法学考察证实本方法精密度高，稳定性好，可作为后续研究的测定方法。

[1]刘龙群，徐丽华，戴嘉.中药穴位敷贴治疗支气管哮喘的疗效观察[J].中国中医急症，2012，21（10）：1573-1579.

[2]邹积宝，孙永强.中药穴位贴敷治疗支气管哮喘研究进展[J].中医外治杂志，2009，18（1）：52-53.

[3]张学梅，刘凡亮，梁文波，等.白芥子提取物的镇咳祛痰及平喘作用研究[J].中草药，2003，34（7）：635-637.

[4]王绪颖，贾晓斌，陈彦.延胡索总生物碱的提取纯化工艺研究[J].中成药，2010，32（11）：1899-1904.

[5]郑维法.甘遂醇提物中4种二萜类化合物的体内抗病毒活性研究[J].中草药，2004，35（1）：65-68.

[6]张会宗，向绍杰，孟莉，等.中药细辛不同提取物平喘活性分析[J].辽宁中医杂志，2011，38（3）：551-552.

[7]冯宝民，余正江，李帆，等.白芥子化学成分的研究[J].大连大学学报，2004，25（6）：43-45.

[8]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：149-150.

[9]杜松云，李其兰，余军.RP-HPLC法测定白芥子中芥子碱硫氰酸盐的含量[J].中国药房，2007，18（27）：2126-2128.

[10]尹珉，王宏，曾祖平，等.HPLC法测定喘宁巴布剂中芥子碱硫氰酸盐的含量[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（1）：21-22.

[11]黄云，张慧芬，王文喜，等.咳喘三伏贴中芥子碱硫氰酸盐的超声提取工艺[J].中国医院药学杂志，2010，30（1）：23-25.

[12]王海波.不同产地白芥子和黄芥子中芥子碱硫氰酸盐的含量比较[J].中医研究，2012，25（1）：68-70.