S-苯乙醇高产菌株的筛选及鉴定

李 成，戚南昌，彭 果，姜青贵，陈 铭，王 丹*

(1.成都医学院生物医学系，四川 成都 610500;2.成都医学院医学检验学院，四川 成都 610500)

手性苯乙醇及其衍生物是合成多种手性药物如 R-地诺帕明、R-托莫西汀、S-氟西汀、R-沙丁胺醇等的重要中间体［1］。为获得光学活性纯的苯乙醇，目前应用最广泛的方法就是催化不对称合成法［2-4］。近年来，生物催化因反应条件温和、产物立体选择性高、对环境友好等优点成为获得光学活性产物的另一个有效途径［5-6］。国内外的相关报道较多［7-9］，而国内仍处于实验室研究的起步阶段。目前，生物催化法合成手性苯乙醇仍无法实现工业化生产的主要因素之一就是作为催化剂的微生物菌株的催化性能不够稳定、产物积累量不高及立体选择性较差等。因此，本文以底物苯乙酮为诱导剂，从成都市某手性化工厂污水池及其附近土壤中筛选可将苯乙酮不对称还原成S-苯乙醇或R-苯乙醇的高产菌株，为生物催化法合成光学活性苯乙醇及其衍生物的工业化应用提供理论及技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微生物样本 从成都某化工厂的污水处理池及其排污口附近土壤中取污水及土样共5份。

1.1.2 主要培养基(g/L) 筛选用培养基(底物诱导):苯乙酮1，蛋白胨1，(NH4)2SO41，琼脂粉17，蒸馏水 1 000 mL，pH自然;斜面培养基(PDA):马铃薯200，葡萄糖20，琼脂粉17，蒸馏水1 000 mL，pH自然;种子培养基(YPD):葡萄糖10，酵母膏5，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0;发酵培养基:蛋白胨 10，酵母膏 5，葡萄糖 20，(NH4)2SO45，KH2PO42，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。上述培养基的灭菌条件均为115℃、30 min。

1.1.3 主要试剂与药品 苯乙酮、R/S-苯乙醇、硅胶GF254均购自成都蜀都化学试剂公司，纯度为99%;S－苯乙醇、R-苯乙醇标准品购自 Sigma-Aldrich，Chiral Select，≥99.0%(sum of enantiomers，GC);PCRmix等分子生物学试剂购自宝生物工程有限公司;引物由华大基因公司上海分公司合成;蛋白胨、葡萄糖等各种培养基购自成都市科龙化工试剂厂;其他试剂均为市售生物化学试剂或分析纯化学试剂。

1.2 方法

1.2.1 菌株分离与纯化 首先将采集的土壤样品配制成悬液，再将污水样本和制成的土壤悬液适当稀释后，涂布于固体筛选培养基，30℃，培养3～5 d。挑取形态各异的单菌落转接于PDA斜面上，30℃，培养3～5 d后于4℃保存。

1.2.2 菌体培养 用无菌牙签从PDA斜面上挑取少量菌苔接种于20 mL种子培养基中，30℃，170 r/min，摇床培养24 h后再按5%的接种量接入50 mL发酵培养基中，30℃，170 r/min，摇床培养48 h，备用。

1.2.3 生物转化 收集发酵液，于6 000 r/min，4℃，离心10 min。将菌体沉淀用pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液洗1～2次后，将2 g湿菌体转接入20 mL pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液中，按终浓度分别为2%(质量体积比)和80 mmol/L加入葡萄糖和底物苯乙酮，30℃，170 r/min，转化48 h。转化结束后，按照体积比1∶1的量向转化体系中加入乙酸乙酯，充分震荡后，静止2～3 min，于6 000 r/min，4℃，离心10 min，取上清液进行TLC检测。转化时间均重复3次以上，获得的底物转化率及产物对映体过量值均为3次转化结果的平均值。

1.2.4 TLC分析(初筛) 将铺好的硅胶薄层板放在烘箱中，按照50℃，30 min;80℃，30 min;110℃，1 h的步骤进行活化。活化后放于干燥器中冷却、备用。在距离薄层板底部边沿约3 cm处用铅笔轻轻划一条直线为点样线，并用铅笔标识点样点，点样量为0.2 mL。展开剂为甲苯和乙酸乙酯的混合液(V甲苯∶V乙酸乙酯=4∶1)，展开时间为8 min左右，并用254 nm UV及碘蒸气熏蚀2种方法显现底物苯乙酮及产物苯乙醇所产生的斑点。并根据斑点的大小和显色的深浅，对菌种的转化能力进行初步判断［10］。

1.2.5 GC分析(复筛) 选取出现产物苯乙醇斑点，并且斑点较大，颜色较深的菌株进入复筛。菌体培养及生物转化过程同上。转化还原反应结束后，反应液用乙酸乙酯萃取(1∶1，体积比)，无水MgSO4干燥后采用GC分析。GC分析使用GC-960气相色谱仪，HP Chiral 10%3-Cyclodextrin手性色谱柱(30 m × 0.32 mm × 0.25 μm);检测条件:载气为氮气，进样器、色谱柱和FID检测器温度分别为220、110和200℃;分流比为1∶100;进样量为0.1 mL。分别以底物的转化率(Conversion)和产物的对映体过量值(e.e.value)表示反应的转化程度和立体选择性，其表达式如下:

其中，C0为底物的初始浓度，C苯乙醇为反应终止时的产物浓度，Cs和CR分别为S型和R型产物的浓度。

1.2.6 遗传稳定性实验 将菌株连续传代20次，于0～4℃的冰箱中保存。再从每1代的斜面培养基上刮1满环菌苔于种子培养基中培养，及转化过程同方法1.2.3所述。再通过GC检测其底物的转化率及产物的e.e.值。

1.2.7 菌种鉴定 ①菌落形态及生理特征分析:利用显微镜及肉眼观察细胞固体平板上的菌落形态，并根据《酵母菌的特征与鉴定手册》［11］所列的酵母菌种鉴定方法进行生化特征分析;②分子生物学鉴定:参考《酵母基因组提取试剂盒》［12］的操作说明，提取酵母基因组DNA。利用通用引物对NL1(5'-GCATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')、NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')扩增其基因组DNA中的26S rDNA D1/D2区域序列。PCR反应体系(50 μL):10 × PCR 缓冲液，5.0 μL;Mg2+(5 mmol/L)，3.0 μL;dNTP(各 2.5 mmol/L)，4.0 μL;引物(10 μmol/L)各1.0 μL;TaqDNA聚合酶 0.5 μL;模板 DNA 2.0 μL;去离子水33.5 μL。PCR扩增程序:94℃ 10 min;94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min;35个循环后72℃ 10 min。取5 μL产物于1%的琼脂糖凝胶(含GV染料)电泳，紫外灯下观测结果。

1.2.8 序列分析和系统树的构建 将扩增出的PCR产物40 μL，送华大基因公司(北京)完成测序工作。根据供试菌株的26S rDNA序列，运用Blast程序在GenBank数据库中分别进行同源序列搜索。根据同源序列搜索的结果，下载相关菌种的26S rDNA序列，与供试菌株的序列一同用Clustal X 1.83软件进行多序列比对，结果采用MEGA3.1 中的邻接法(Neighbor.Joining)进行系统树的构建，并用Bootstrap对进化树进行1 000次可信度分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离与纯化

筛选培养基以苯乙酮作为唯一碳源，目的是为了筛选出可以利用底物苯乙酮生长，并对底物有一定耐受力的菌株。本实验从5份微生物土壤及污水样品中，共筛选出224株形态各异的菌株。

2.2 苯乙醇高产菌株的筛选

应用摇瓶培养配合TLC检测方法，快速筛选出8株可将苯乙酮转化成苯乙醇的菌株，其中菌株bs5-1的结果最好，GC检测如图1所示，bs5-1可将苯乙酮不对称合成S-苯乙醇，底物转化率为43.02%及产物对应体过量值为96.84%。

转化后反应液中苯乙酮的GC-MS分析鉴定结果如图2所示，(1)为苯乙酮的标准品，(2)为转化反应后反应液中剩余的底物苯乙酮，图中120是苯乙酮的分子离子峰;105是苯乙酮掉一个甲基后的碎片峰;77是苯乙酮掉了一个酮基和一个甲基后的碎片峰。从这些数据来看，转化后的反应液中含有未被转化的底物苯乙酮。

图1 气相色谱检测bs5-1催化苯乙酮的不对称还原反应Fig.1 Gas chromatography(GC)of the asymmetric reduction of acetophenone catalyzed by bs5-1

图2 GC-MS检测转化后反应液中苯乙酮Fig.2 GC-MS of acetophenone from the transformed reaction solution

图3是转化反应液中产物苯乙醇的GC-MS鉴定谱图，(3)为苯乙酮的标准品的质谱图，(4)为转化反应液中产物苯乙酮的质谱图，图中122是苯乙醇的分子离子峰;107是苯乙醇断掉一个甲基后的碎片峰;79是苯乙醇断掉侧链的碎片峰。从这些数据来看，底物苯乙酮的羰基确实发生了还原反应，还原产物为苯乙醇。

图3 GC-MS检测转化后反应液中苯乙醇Fig.3 GC-MS of phenylethanol from the transformed reaction solution

2.3 催化活性稳定性研究

将bs5-1连续传了20代后，其催化活性较为稳定，如图4所示，菌株bs5-1的底物转化率c%及产物 e.e.%分别稳定在(43±1.25)%和(97±0.36)%，说明这2株菌的催化活性较为稳定，具有工业化应用的潜力。

图4 菌株传代次数对bs5-1不对称还原苯乙酮的影响Fig.4 Effect of strain-passage numbers on the asymmetric reduction of acetophenone catalyzed by bs5-1

2.4 菌株形态学及生理、生化特性分析

如图5所示，菌株bs5-1的菌落特征:粉红色、圆形、有光泽、边缘整齐、不透明、质地均匀、表面光滑、湿润。借助高倍荧光显微镜观察菌株bs5-1的革兰染色为阳性，未见菌丝体，细胞呈卵圆形，如图6。菌株bs5-1的部分生理生化特征与胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)相同，见表1。

图5 菌株bs5-1的菌落形态Fig.5 Colonial morphology of bs5-1

图6 菌株bs5-1的细胞形态Fig.6 Cellular morphology of bs5-1

表1 菌株bs5-1的部分生理生化特征Table 1 Some physiological and biochemical characteristics of strain bs5-1

2.5 26S rDNA D1/D2区域序列分析

PCR获得了酵母bs5-1的26S rDNA D1/D2区域基因的部分片断，利用BLAST软件将该序列与GenBank中收录的DNA序列进行比对，并与相关菌种构建进化树。图7显示，菌株bs5-1与Rhodotorula mucilaginosa ATCC 32763(AF 335986.1)，表明两者亲缘关系最近，菌株 bs5-1的26S rDNA D1/D2区域序列长度为591 bp，其在GenBank数据库中的登陆号为(JX014238)。

图7 基于26S rDNA D1/D2区域序列和Neighbor-Joining法构建的系统发育树Fig.7 Phylogenetic tree based on 26S rDNA D1/D2 regional sequence and neighbor-joining analysis

3 讨论

在生物合成手性芳香醇的相关研究中，将底物分子中的羰基不对称还原生产光学活性手性醇是一条有效途径，其中研究最为广泛的底物就是羰基两侧分别具有苯基和烷基的物质，因此苯乙酮被视为检测还原性生物催化剂的立体化学倾向性的底物分子，是最理想的模式底物［13］。因此，本文以苯乙酮诱导底物，从自然界中筛选到1株可将苯乙酮不对称还原成S-苯乙醇的菌株bs5-1，当底物浓度为80 mmol/L、静息细胞量为0.1 g/mL、添加的辅助底物葡萄糖浓度为2%、转化体系初始pH值为6.8、在30℃条件下转化48 h时，底物转化率为43.02%，产物 R-苯乙醇的 e.e.值为96.84%。根据菌株bs5-1的部分生理生化特征，并结合其26S rDNA Dl/D2区域的分析结果，初步鉴定bs5-1为胶红酵母。下一步将对其发酵条件、转化条件进行优化研究，旨为生物催化不对称合成S-苯乙醇及其衍生物的工业化生产提供理论及技术支持。

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