食品中金黄色葡萄球菌平板计数不确定度的评定

张洪军，张铭华

(辽宁省朝阳市产品质量监督检验所，辽宁朝阳 122000)

金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都存在。因而，食品受其污染的机会很多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品等。剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等因金黄色葡萄球菌污染而引起的中毒事件也有报道。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第2位，仅次于大肠埃希菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大占到45%，我国每年也有此类中毒事件发生。因此，做好金黄色葡萄球菌的检测尤为重要，特别是卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金黄色葡萄球菌限量存在，而金黄色葡萄球菌计数存在很大的分散性，故做好金黄色葡萄球菌计数不确定度评定尤为重要。

1 检验方法

依据GB4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》第2法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数进行检验，程序见图1。

1.1 样品制备

取1 kg非阳性速冻水饺，解冻后向其中加入100 mL磷酸盐缓冲液，同时加入制备好的金黄色，葡萄球菌标准菌株，用拍击式均质器拍打2 min制成待测样品。

图1 金黄色葡萄球菌平板计数检验程序Fig.1 Program of Staphylococcus aureus by plate counter

1.2 样品检测

取待测样品25 g，加入到225 mL无菌磷酸盐缓冲液中，用拍击式均质器拍打2 min，制备成1∶10样品匀液，用无菌吸管吸取样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL磷酸盐稀释液的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液面)，振摇试管使其混合均匀，制成1∶100的样品匀液。每递增稀释1次，换用1次无菌吸管或吸头，制备10倍系列稀释样品匀液。选择合适的2个稀释度，均匀涂布在Baird-Parker培养基上，于36℃条件下培养48 h，计数的同时进行血浆凝固酶试验，报告结果［1］。

2 数学模型及不确定度来源

2.1 数学模型

T—样品中金黄色葡萄球菌菌落数;

A—某一稀释度典型菌落的总数;

B—某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数;

C—某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数;

d—稀释因子。

(注:由于本实验采用阳性菌株添加，故B/C=1)

2.2 不确定度分量的主要来源

①样品制备过程中引入的不确定度;②样品稀释过程中引入的不确定度;③向培养基加样时引入的不确定度;④在Baird-Parker培养引入的不确定度。

3 各分量不确定度的评定

3.1 样品制备过程中引入的不确定度评定

3.1.1 天平引入的不确定度 在无菌条件下，用精度为0.1 g的天平称取25.0 g样品时，重复称量10次，样品质量均为25.0 g，所以此处只考虑天平本身引入的不确定的评定。由天平检定证书可知，最大允许差为0.1。由于按级使用的数字式仪表、测量仪器最大允差误差导致的不确定度属于矩形(均匀)分布。所以天平引入的标准不确定度为:

3.1.2 玻璃器皿引入的不确定度 用250 mL的量筒量取225 mL无菌磷酸盐缓冲液加入，量筒按JJG196-2006常用玻璃量器的容量允差为2.0 mL［2］，由于按级使用的数字式仪表、测量仪器最大允差误差导致的不确定度属于矩形(均匀)分布，则玻璃容器的标准不确定度分别为:

3.1.3 天平和玻璃器皿产生的相对合成不确定度

3.2 样品稀释过程中引入的不确定度评定

3.2.1 1 mL量出式吸量管引入的不确定度 样品10倍系列梯度稀释采用1 mL量出式分度吸量管进行。JJG196-2006常用玻璃量器规定，20℃时1 mL(B 级)的容量允差分别为 ±0.015［2］，取矩形分布，则它们的标准不确定度分别为:

3.2.2 10 mL量出式吸量管引入的不确定度样品10倍系列梯度稀释采用10 mL量出式分度吸量管进行。JJG196-2006常用玻璃量器规定，20℃时10 mL(B 级)的容量允差分别为 ±0.1［2］，取矩形分布，则它们的标准不确定度分别为:

该步产生的相对不确定度U(稀释)rel，可根据泊松关于微生物培养产生的不确定度定量测定理论中的公式［3］计算:

本次试验在20℃标准温度的环境中进行，因此，忽略溶液温度与校准时温度不同引起的不确定度。若溶液温度不为20℃时，则必须考虑温度对量器体积的影响。

3.3 向培养基加样时引入的不确定度评定

用1 mL分度吸管(A级)吸取1 mL样品匀液以 0.3、0.3、0.4 mL 接种量分别加入 3 块Baird-Parker平板。20℃时1 mL(A级)的容量允差分别为±0.008，取矩形分布，则它们的标准不确定度分别为:

3.4 在 Baird-Parker培养引入的不确定度的评定

同一样品重复测20次，取其平均值作为测量结果，20次检测结果见表1。

表1 样品测量结果Table 1 The detection result of sample

合成标准不确定度为:

3.5 食品中金黄色葡萄球菌平板计数的合成不确定度和扩展不确定度［4］

3.5.1 食品中金黄色葡萄球菌平板计数的合成不确定度

3.5.2 食品中金黄色葡萄球菌平板计数的扩展不确定度 取置信概率p=95%，自由度v=20－1=19，由t分布表可得k=2.09于是

所以:lgx=3.564 6 ±0.064，也就是:3.500 6≤lgX≤3.628 6

去反对数:3 167≤X(金黄色葡萄球菌平板计数)≤425 2

4 小结

本次实验对培养基、磷酸盐缓冲液、吸管、均质袋、未添加阳性菌株样品做了相应的空白验证，同时对无菌室空气及紫外灯灭菌效果进行了环境监控，对培养基质量进行了技术验收，结果均符合要求。本次实验主要对不确定度贡献较大的样品取样、样品稀释、样品加样体积、培养基培养等方面进行不确定度的评定。

平板测试的结果(在测试结果小于10 cfu的情况下，可能接近于正态分布)不是正态分布，属于偏态分布。因此，将平板测试的结果的数据首先要转换成对数，使分布接近正态分布。

［1］ GB4789.10-2010.食品安全国家标准 食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验.

［2］ JJF 196-2006.中华人民共和国国家计量检定规程.

［3］ 卢春凤，邢荣花，史方，等.食品中大肠菌群MPN法结果不确定度的评定［J］.科技致富导向，2011，(33):256.

［4］ 王晓红，姜娴.食品中菌落总数检测结果的不确定度评定［J］.中国卫生检验杂志，2011，21(11):2799-2800.