红果参多糖的提取纯化及抗氧化活性研究

陈莉华，龙进国，谭林艳，廖 微

1吉首大学化学化工学院;2吉首大学“植物资源保护与利用”湖南省高校重点实验室，吉首 416000

红果参属桔梗科多年生草本植物，收载于《中国药典》2010版一部［1］，别名蜘蛛果、山荸荠等，学名长叶轮钟草［Campnumoea lancifolia(Roxb.)Merr］，味甘而微苦，性平;具有补虚益气、祛痰止痛等功效，主要用于治疗跌打损伤、气虚乏力、肠绞痛等，还可用于治疗肺痨咳嗽、瘰疬、疝气等。桔梗科植物大多具有野生习性，兼具药用、食用、滋补和保健等功效，对该科党参属植物的研究较多，但未见对红果参研究的相关报道。

天然多糖由于具有抗氧化、防衰老、抗肿瘤、降血糖等生物活性在食品和药品开发与利用方面已引起广泛关注。从常见的植物如海金沙草［2］、芦荟［3］、芦笋［4］、野艾蒿［5］提取纯化多糖的研究不断见诸报道。国内外目前已报道了200多种天然多糖［6］，其中95%以上为植物多糖，充分利用植物多糖的天然无毒性开发各种功能性食品和保健品既顺应时代的发展又满足了人类对天然产品返璞归真的渴望。本文提取红果参多糖，详细研究其抗氧化活性，为红果参综合开发利用提供理论基础和实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器试剂与材料

Gzx-9070MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);UV75TCRT紫外分光光度计(日本岛津);K-201B-Ⅱ旋转蒸发器(郑州长城科工贸有限公司);KQ-250E型超声波清洗机(上海弗润茨机电系统有限公司);电子天平(上海维平科学仪器有限公司);恒温箱(上海基玮试验仪器设备有限公司)。

样品采于吉首大学“植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室”红果参基地、无水乙醇、KI、I2、冰醋酸、三氯甲烷、正丁醇、HCl、NaNO2、石油醚、Tris邻苯三酚、FeSO4、H2O2、盐酸萘乙二胺、氨基苯磺酸、淀粉、VC(抗坏血酸)、苯酚、浓硫酸、水杨酸等均为分析纯;动物油为市售新鲜猪板油熬制而成，金健牌茶籽油(植物油)购于吉首本地超市。

1.2 试验方法

1.2.1 红果参多糖的提取纯化

红果参果实—干燥箱中60℃干燥—粉碎—过筛—热水超声提取(80℃，液料比20 mL/g，45 min，三次)—过滤—浓缩—醇沉过夜(4倍体积无水乙醇)—离心干燥—粗多糖制品—溶解脱色(石油醚多次冲洗)—Sevage法除蛋白—上层液浓缩—醇沉过夜(4倍体积无水乙醇)—离心干燥—精多糖制品。

1.2.2 红果参多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

1.2.3 红果参多糖清除羟基自由基

建立Fenton反应体系模型［7］，以空白液为参比在波长510 nm下测其吸光值A0、Ax及Ax0，重复三次测定，按下式计算羟基自由基的清除率:

式中，A0为空白对照液吸光值;Ax为待测样品液吸光值;Ax0为本底吸光值。

1.2.5 红果参多糖对超氧阴离子自由基的清除能力测定

按照谭萍等［9］方法略有改变。量取pH为8.2的Tris-HCl缓冲液4.8 mL和1 mL不同浓度的待测液于10 mL试管中，置于25℃水浴中保温20 min后立即加入0.3 mL 30 mmol/L的邻苯三酚溶液，迅速摇匀后倒入比色皿中，用10 mmol/L的HCl溶液为空白液，在325 nm波长处，每间隔30 s测吸光值一次，共反应9 min;以吸光值A对反应时间T作线性关系图，斜率为V1，空白对照组以5 mL待测液代替样品同样测定，斜率为V2，按下式计算清除率:Y(%)=［1-V1/V2］ × 100，式中Y为清除率，V1和V2分别表示待测样品和空白对照的吸光值随时间的变化率。

1.2.6 红果参多糖抑制油脂氧化能力的测定

在无水酸性条件下，油脂中的过氧化物使I-定量氧化成I2，I2与I-结合生成易溶于水的，利用的颜色与标准碘液进行比较定量。按照文献［10］的方法，在系列干燥的具塞25 mL比色管中，分别加入2∶3的氯仿—冰醋酸混合溶液7 mL，碘化钾饱和碱液0.2 mL，每次加液后摇匀。再加蒸馏水5 mL，然后分别加入碘标准液 0.4、0.6、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mL。此相当于每管含有 I2:40、60、80、120、140、160、180、200、220 μg。再加蒸馏水至刻度，加塞摇匀，静置5～10 min，待分层后，取上清液移入l cm的石英比色皿中，以蒸馏水作参比，在353 nm波长下测吸光值A。根据所对应的浓度作标准曲线。

采用国际上通用的烘箱强化贮存法使油脂发生氧化酸败变质并求出过氧化值，测定多糖提取物、对照品加入前后油脂的过氧化值用于衡量其对油脂的抗氧化能力。称取20 g油脂，加入2 mL提取物，搅拌均匀后，放入烘箱中强化保存1 h后，取待测样品1 mL，加入2 mL氯仿-冰醋酸溶解，再加入1 mL 10%KI溶液，加盖摇匀30 s，并置于暗处反应3 min。取出后立即用水稀释并加入1 mL 1%淀粉溶液，加塞，颠倒混匀2～3次，静置5～l0 min，待水相澄清后，取上清液于1 cm石英比色皿中，在波长353 nm处测吸光值，根据吸光值和标准曲线计算碘生成量。同时做空白实验，按下式计算油脂过氧化值(POV)及提取液对油脂的保护率:

式中:W表示油脂质量/kg。

式中:η为提取液对油脂的保护率/%;

POV初为未对油脂进行强化氧化时的过氧化值/(mmol/kg);

POV末1为添加红果参多糖的油脂强化氧化后的过氧化值/(mmol/kg);

POV末2为未添加红果参多糖的油脂强化氧化后的过氧化值/(mmol/kg)。

2 结果与讨论

2.1 红果参多糖含量

以葡萄糖为对照品，490 nm下测得吸光值(A)与葡萄糖浓度(c)之间的回归方程为:A=14.64c-7.86 ×10-3，R2=0.9973。葡萄糖质量浓度在 0.01～0.06 mg/mL范围内线性关系良好。将制得红果参多糖溶解稀释至一定浓度，按上方法测定红果参多糖含量。用红果参 32.9174 g，按 1.2.1提取得2.8611 g红果参多糖，提取率达8.69%，红果参多糖中葡萄糖含量为92.8%。

2.2 红果参多糖对羟基自由的清除

按照实验方法，探究了不同浓度的红果参多糖(PS)对羟基自由基的清除效果，结果见图1。

图1 红果参多糖对羟基自由基的清除Fig.1 ·OH scavenging rates of Hong Guo Ginseng polysaccharide(PS)and ascorbic acid(VC)

羟基自由基(·OH)是已知的最活泼的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基，清除羟基自由基可能是生物预防疾病的有效方式之一。由图1可知红果参多糖有很强的清除羟基自由基的作用，随着质量浓度的增加，红果参多糖的清除能力依次增加。红果参多糖和VC质量浓度分别为0.30 mg/mL和0.14 mg/mL时，清除率达到50.00%。在相同质量浓度下，小于0.12 mg/mL时，红果参多糖清除·OH的能力大于VC，但大于0.12 mg/mL后，对照品VC的清除能力迅速上升，在0.35 mg/mL后，VC对羟基自由基的清除率接近100%，而红果参多糖对清除率羟基自由基有明显的浓度效应关系。

2.3 红果参多糖对亚硝基的清除

按照实验方法，探究了不同浓度的红果参多糖(PS)对亚硝基)的清除效果，结果见图2。

图2 红果参多糖对亚硝基的清除Fig.2 scavenging rates of Hong Guo Ginseng polysaccharide(PS)and ascorbic acid(VC)

亚硝基是人体致癌的根源之一，对于亚硝基的清除是减少致癌的方法之一。由图2可知红果参多糖对亚硝基的清除作用不大，当提取物中多糖质量浓度达0.65 mg/mL时对亚硝基的清除仍没超过10%，远远低于VC的清除效果。

2.4 红果参多糖对超氧阴离子自由基的清除

按照实验方法，探究了不同浓度的红果参多糖(PS)对超氧阴离子自由基的清除效果，结果见图3。

图3 红果参多糖对超氧阴离子的清除Fig.3 scavenging rates of Hong Guo Ginseng polysaccharide(PS)and ascorbic acid(VC)

2.5 红果参多糖抗油脂氧化效果

在353 nm波长下，I2含量(W/μg)对吸光值(A)的线性回归方程为:A=0.00435W-0.24996，R2=0.9875。

按实验方法，探究了当烘箱温度60℃和强制放置时间1 h的条件下，不同质量浓度的红果参多糖(PS)对动物油和植物油的抗氧化效果，结果见图4、图5。

由图4可知，当红果参多糖(PS)作为抗动物油氧化抑制剂时，在0.1 mg/mL时即达到最大保护率(58.80%)，而 VC 在 0.15 mg/mL 时达到最大保护率(55.03%)，随后当质量浓度增大时，红果参多糖的保护率缓慢下降而VC的保护率急速下降;由图5可知，当红果参多糖作为抗植物油氧化抑制剂时，在0.1 mg/mL时即达到最大保护率(56.39%)，而 VC在0.15 mg/mL时达到最大保护率(98.24%)，随后当质量浓度增大时，红果参多糖和VC的保护率均急速下降。比较图4和图5可看出，在相同浓度下，红果参多糖对动物油的保护作用稍强于VC，对植物油的保护作用稍弱于VC，红果参多糖对动物油和植物油的保护作用大体一致，VC对动物油的保护作用稍弱于植物油;但二者对动物油和植物油的抗氧化能力变化趋势大体相同，抗氧化能力先随浓度成正相关，达到一定浓度后抗氧化能力随浓度增加而降低。

3 结论

研究表明，红果参多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除和油脂的氧化抑制均有明显作用。红果参可进行大面积人工种植，提取多糖工艺简单，作为一种新的天然、保健的绿色食品抗氧化剂具有良好的开发前景。

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