实时荧光定量PCR快速诊断肺炎链球菌

颜善活，孙 雷，符可鹏，卓永光，杨善业，樊祖茜，黄永霞

(广西壮族自治区钦州市妇幼保健院，广西 钦州 535000)

肺炎链球菌是一种可引发肺炎、脑膜炎、菌血症、中耳炎及鼻窦炎等疾病的细菌[1]。各个年龄段人群都可能受感染，而2岁以下的幼儿最容易罹患，如果没有得到及时的诊断和治疗，患者可能会失聪、智障、瘫痪、延迟会话能力，甚至死亡[2]。目前，临床对社区获得性肺炎患者诊断的金标准是通过细菌培养的检测方法来确定病原菌，该方法虽然能对部分病例进行诊断和确诊，但在临床应用中仍存在许多不足[3]。近年来逐渐发展起来的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)为肺炎链球菌提供了快速而敏感的诊断方法，解决了传统方法的不足，相比细菌培养法其具有无需进行细菌培养、不受药物影响、3～5 h内即可完成诊断等特点，不仅能快速对肺炎链球菌感染进行诊断，更重要的是能及时控制病情的发展。本研究中，为了验证引物及探针的敏感性和特异性，分别利用肺炎链球菌自溶素(Lyt)和溶血素(Ply)的基因引物及探针对肺炎链球菌、非肺炎链球菌、不同浓度梯度的肺炎链球菌以及临床标本进行荧光定量PCR。同时，对实时荧光定量PCR扩增产物的量与培养阳性的相关性进行了初步探讨。

材料和方法

一、材料

1.标本来源 标本来源于2010年4月至2011年12月钦州市妇幼保健院临床分离的非重复的肺炎链球菌、经过鉴定的非肺炎链球菌以及临床送检的痰标本。

2.主要仪器和试剂 荧光定量PCR仪为达安基因公司DA7600产品，紫外分光光度计、高速离心机、电泳仪等购自美国Labnet公司，电泳凝胶成像分析系统购自美国BIO-RAD公司，荧光定量PCR系列试剂购自天根生化科技(北京)有限公司。

3.PCR引物及Taqman探针的设计与合成经参考有关文献和检索GenBank，分别以肺炎链球菌的lyt和ply基因为目的序列合成引物及探针。ply基因[4]引物序列为:forward 5'-TGCAGAGCGTCCTTTGGTCTAT-3'，reverse 5'-CTCTTACTCGTGGTTTCCAACTTGA-3';ply基因探针为:probe FAM-5'-TGGCGCCCATAAGCAACACTC GAA-3'-TAMRA，lytA 基因[5]引物序列为:forward 5'-ACGCAATCTAGCAGATGAAGC-3'，reverse 5'-TGTTTGGTTGGTTATTCGTGC-3'，lytA基因探针为:probe FAM-5'-TTTGCCGAAAACGCTTGATACAGGG-3'-TAMRA，引物及探针均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

二、方法

1.肺炎链球菌的培养及鉴定 取临床痰液标本和标准菌株肺炎链球菌(ATCC 49619)，分别接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，置于5%的二氧化碳培养箱中，在37℃条件下培养18～24 h。采用革兰染色镜检、奥普托欣(optochin)和胆汁溶解试验鉴定。

2.临床痰液标本及培养后的菌株DNA的提取 取接种剩余的痰标本1 mL于1.5 mL离心管中或挑取纯培养的菌株悬浮于1 mL无菌生理盐水中，15000×g离心5 min，弃上清。在沉淀中加入裂解液100～150 μL，然后100℃水浴10 min，10000×g离心10 min，上清液作为模板DNA。

3.实时荧光定量PCR 以上述方法提取经过培养和鉴定后的10株肺炎链球菌DNA，分别以其DNA为模板进行实时荧光定量PCR，25 μL反应体系:引物 1 μL，模板 2 μL，去离子水 9.5 μL，实时荧光定量 PCR mix 12.5 μL。扩增条件为:93℃预变性3 min;93℃变性30 min，60℃ 1 min，共42个循环，记录试验结果并保存扩增曲线。

4.特异性试验 对通过培养并鉴定后的脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、乳糖奈瑟菌、副流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、假单胞菌、无乳链球菌、酿脓链球菌、卡他布兰汉菌以及人类细胞组织分别提取DNA，进行实时荧光定量PCR检测，同时以标准菌株肺炎链球菌(ATCC 49619)作为阳性对照，无菌蒸馏水作为空白对照。

5.敏感性试验 用棉签刮取培养基上的纯菌苔，按照天根DNA试剂盒中的操作说明提取菌体染色体DNA，可直接用作PCR模板或置－20℃保存备用。用紫外分光光度计测得参考菌株DNA浓度并调整至10 ng/μL，用超纯水10倍系列稀释，使其终浓度为 1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg，稀释好的DNA需立即进行实时荧光定量PCR检测，并以无菌蒸馏水作为空白对照。

6.临床标本的实时荧光定量PCR检测 采用实时荧光定量PCR和传统的细菌培养法同时检测200例临床痰液标本。每次扩增均以标准菌株肺炎链球菌(ATCC 49619)全基因组DNA为阳性对照，超纯水为阴性对照;所有相同的标本和阴阳性对照都设有两孔以进行平行检测。

三、统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件进行 χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、实时荧光定量PCR扩增结果

利用肺炎链球菌的lyt与ply基因为目的序列设计的引物及Taqman探针，分别对10株经过培养及鉴定的肺炎链球菌进行检测，结果显示10株肺炎链球菌均获得了明显的扩增信号，表明合成的引物及Taqman探针均能有效的扩增并检测出肺炎链球菌的lyt基因及ply基因。见图1(a)、图1(b)。

二、特异性试验

利用引物及Taqman探针分别对经分离的12株非肺炎链球菌以及1例人类细胞组织DNA进行荧光定量PCR检测，结果显示除了肺炎链球菌的阳性对照DNA显示为阳性外，其他细菌均无明显的扩增信号，表明所合成的引物及Taqman探针对肺炎链球菌的lyt基因及ply基因具有高度的特异性。见图1(c)、图1(d)。

三、敏感性试验

分别选取菌悬液浓度为1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg的肺炎链球菌DNA进行定量PCR检测，ply基因与lyt基因的引物与探针的荧光定量PCR结果显示，各个浓度的肺炎链球菌DNA均具有明显的扩增信号，其检测的最低肺炎链球菌DNA浓度可低至100 fg。见图2。

图1 ply及lyt基因引物与探针的特异性试验

图2 ply和lyt基因引物与探针的敏感性试验

四、临床标本检测结果

利用实时荧光定量PCR和细菌培养法同时检测200例临床标本，荧光定量PCR检测的肺炎链球菌阳性标本42例(阳性率为21%)，而培养法阳性16例(阳性率为8%)，2种方法比较差异有统计学意义(P＜0.05)。ply及lyt基因的不同扩增次方量下细菌培养阳性的结果见表1，培养阳性的临床标本在荧光定量PCR检测中均为阳性，而传统的细菌培养法只能检测部分荧光定量PCR扩增量在6次方以上的临床标本。结果表明，实时荧光定量PCR相比传统细菌培养法能更快速、特异、敏感地进行肺炎链球菌的检测。

表1 细菌培养和实时荧光定量PCR不同扩增次方的阳性标本量的统计

讨 论

目前，细菌培养法诊断肺炎链球菌在临床应用中存在许多不足，近年来逐渐发展起来的分子生物学方法为肺炎链球菌的检测提供了新的方法[6-8]，而实时荧光定量 PCR因其具有快速、准确、特异性高、重复性好等特点，目前已广泛用于基因表达和病原体检测等诸多领域。本研究通过利用合成的引物及Taqman探针对肺炎链球菌、非肺炎链球菌、不同浓度梯度的标准菌株以及临床标本进行实时荧光定量PCR，结果显示其不仅能特异、敏感的扩增并鉴定分离的肺炎链球菌菌株，而且还能直接应用于临床标本的检测。

肺炎链球菌的lyt基因与ply基因均为常用的靶基因应用于肺炎链球菌种属的鉴定。lyt基因是肺炎链球菌的致病因子之一，对肺炎链球菌lyt基因测序显示，肺炎链球菌种内各血清型的lyt基因序列高度保守，且与其他种的链球菌存在较大差异[9]。ply基因是肺炎链球菌的 ply基因，Carvalho 等[10]分别以 lyt、ply及 psaA 基因为目的基因设计引物和探针，并通过荧光定量PCR检测肺炎链球菌对比其敏感性和特异性，其结果显示lyt和psaA基因的特异性相对较高，而ply基因的引物和探针除了肺炎链球菌外，还能够扩增出假肺炎链球菌。为了避免ply基因扩增中出现非特异性扩增，同时为了调查假肺炎链球菌的流行及分布情况，我们采用双重检测的试验，对分析鉴定的原始菌液DNA标本和临床送检标本的DNA分别利用所合成的lyt及ply基因引物和探针进行荧光定量PCR，结果lyt及ply基因引物和探针均能进行特异性的扩增，试验中未出现扩增结果不一致的现象。在后续试验中，我们将加大扩增标本的量，鉴定并分离出假肺炎链球菌，以检测肺炎链球菌及假肺炎链球菌的流行情况。

利用实时荧光定量PCR和细菌培养法同时检测200例临床标本，实时荧光定量PCR检测出42例肺炎链球菌阳性(阳性率为21%)，而培养法阳性标本为16例(阳性率为8%)，2种方法比较差异有统计学意义。其中有26例实时荧光定量PCR阳性而细菌培养法阴性标本，其原因可能为:采集标本的肺炎链球菌的量较少，在与其他细菌竞争中生长被抑制，从而导致结果阴性;也可能是患者采样前使用过一些抗菌药物从而导致培养阴性。

在试验中，培养阳性的临床标本在荧光定量PCR检测中均为阳性，并且其扩增量都在6次方以上，因此我们推断，培养法检测肺炎链球菌的敏感性在100 pg以上。实时荧光定量PCR检出量可低至100 fg，甚至更低，其敏感性完全达到临床检测的要求，当然该方法也适合进行流行病学分析调查。

本研究利用肺炎链球菌的lyt和ply基因为目的序列设计并合成的引物和Taqman探针应用于肺炎链球菌的检测，具有敏感性高、特异性强、药物影响小、检测速度快、人力花费少、经济实惠等特点，为临床肺炎链球菌的检测提供了新的方法。

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