RGD活性肽对环磷酰胺诱导HL7702正常肝细胞损伤的保护作用

张 良 韩 丹 赵诗萌 吴红敏 (中国医科大学附属第一医院新生儿科，辽宁 沈阳 110001)

广谱抗肿瘤药物环磷酞胺(CTX)属潜伏氮芥类烷化剂，可诱导产生染色体变异，导致细胞周期、形态、生理等方面发生改变，但其缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也破坏机体的正常细胞。肿瘤抑素30肽(T30)是含有多个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的抗肿瘤多肽〔1〕，具有专一作用于肿瘤细胞的功能，对正常细胞没有杀伤;可以促进多种肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，与化疗药物CTX联合应用具有明显的抗肿瘤叠加作用。至今RGD多肽对于CTX导致的正常细胞损伤的影响没有报道。本研究观察T30肽对CTX诱导的HL7702凋亡是否具有抑制作用，为靶标的抵抗化疗损伤药物研究提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料 HL7702由日本医科大学生命科学研究中心提供。水溶性四氮唑(WST-1)凋亡检测试剂盒购自碧云天，锚定蛋白-异氰硫酸荧光素-碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒购自凯基生物科技;EB、AO购自罗氏。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在含10%灭活新生牛血清的RPMI1640完全培养液中，置37℃，5%CO2培养箱中培养，2～3 d传代1次。

1.2.2 绘制细胞生长曲线 将对数生长期的HL7702细胞用0.25%胰酶消化，含10%胎牛血清的RPMI1640培养液吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1×104/ml，每孔100 μl分别加入到4块96孔培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。24 h细胞贴壁后，向各孔中分别加入 CTX(浓度为4 μg/ml)、CTX+RGD-T30(浓 度 依 次 为 20、40、60、80、100 μg/ml，每个浓度设5个复孔)。分别培养24 h，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次后，各孔加入100 μl无血清培养基和10 μl WST-1，继续在37℃，5%CO2饱和湿度培养箱培养1 h。酶标仪测定各孔光密度(OD值)，空白孔调零，选择450 nm为测定波长，630 nm为参考波长，以药物浓度为横坐标，OD为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复三次，确定结果稳定性。

1.2.3 AO/EB双染色实验 24孔板按5×104个细胞/孔密度接种细胞悬液，培养24 h后向各孔中分别加入CTX(浓度为4 μg/ml)，CTX+RGD-T 30(浓度依次为 20、40、60 μg/ml)，继续培养24 h，弃去培养基，PBS清洗2遍，每孔分别加200 μl AO染液(100 μg/ml)及 200 μl EB 染液(100 mg/L)，室温放置5 min，在荧光显微镜下观察。

1.2.4 Annexin-V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞处理方法同上，PBS清洗细胞2次，0.25%胰酶消化细胞，500 g离心5 min收集细胞。收集1×106单细胞悬液.，加入Binding buffer 100 μl 和 Annexin-V-FITC(20 μg/ml)10 μl，室温避光30 min。加入 PI(50 μg/ml)5 μl，用 Binding buffer加至 400 μl，用碘化丙锭染色流式细胞术(FACS)进行定量检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量数据以±s表示，组间比较采用独立样本的t检验。

2 结果

2.1 RGD-30T对CTX诱导的HL7702生长抑制的影响 在单独存在CTX时，HL7702均处于生长抑制状态，当加入 RGDT30肽时，实验组细胞生长抑制明显改善，并随着RGD多肽浓度的增加，450 nm波长处的吸光值呈上升趋势，呈现出浓度依赖性，即细胞生长速度增加，T30 肽浓度为 20、40、60、80、100 μg/ml时 OD 值分别为 0.184 ± 0.03、0.192 ± 0.041、0.372±0.091、0.579±0.175、0.613±0.216。当 T30肽浓度达到40 μg/ml时，促进生长作用显著增加，各组与阴性对照组比较具有统计学意义。T30肽浓度在20～40 μg/ml时，这种保护作用呈平台期特征。结果显示，T30肽对CTX诱导的HL7702生长抑制具有拮抗作用。

2.2 RGD-30T对CTX诱导的HL7702细胞凋亡形态的影响单独应用CTX组，绝大部分细胞核被染成橙红色，核皱缩或碎裂，为晚期凋亡或死亡细胞。T30肽与CTX联合应用时，T30肽强烈抑制了CTX对HL7702的损伤作用，凋亡细胞明显减少，绝大多数细胞形态饱满，几乎没有死亡细胞。AO/EB染色实验结果表明，从形态角度观察，RGD-T30对 CTX诱导的HL7702细胞凋亡形态具有抑制作用。见图1。

图1 不同浓度T30肽与HL-7702细胞的保护作用

2.3 RGD-30T对CTX诱导的HL7702细胞凋亡的影响 Annexin-V-FITC/PI染色，CTX单独处理的HL7702细胞组24 h晚期凋亡细胞占30.2%，CTX与T30共处理细胞组凋亡细胞分别占19.2%和13.1%、7.1%。可见，随着T30肽浓度增加，凋亡细胞逐渐减少，活细胞和早期凋亡细胞明显增多。CTX单独处理的HL7702细胞组24 h早期凋亡细胞占57.2%，CTX与T30共处理细胞组凋亡细胞分别占29.7%和17.1%、9.5%。可见，随着T30肽浓度增加，早期凋亡细胞逐渐减少，活细胞明显增多。

3 讨论

恶性肿瘤的治疗手段有多种，化疗仍是目前极为重要的基本手段之一〔2〕，但其靶向性差。多数抗肿瘤药物均可在杀死肿瘤细胞的同时无选择地破坏正常组织，广泛而严重的急性和慢性化疗损伤，限制了在癌症治疗中的作用〔3〕。因此在抗肿瘤治疗时，能达到最大杀伤肿瘤细胞并对正常组织产生最小破坏作用的临床目的已经成为化疗药物临床应用目标。这方面的研究也是当今抗肿瘤药物研究与开发领域的一大热点〔4〕。

Arap等〔5〕获得了能特异性和肿瘤新生血管结合的小肽RGD，将其与具有抗血管形成作用的常规化疗药物阿霉素交联，发现导向性的阿霉素可以使人乳腺癌移植瘤小鼠存活时间明显延长，且毒副反应降低。目前研究发现，含有RGD序列的蛋白或肽，与整合素结合，参与细胞的分化、增殖、凋亡、黏附、形态发生等生物学过程，在组织器官发生、创伤修复及肿瘤的发生、浸润转移等生理和病理过程中发挥重要作用〔6〕。肿瘤抑素27肽与RGD活性三肽〔7〕结合后形成T30肽，具有更强的抑制血管新生抗肿瘤作用〔8〕，在与CTX的实验中发现，T30肽与CTX协同抗肿瘤时，不仅可以增强CTX的抗肿瘤作用，同时，可能有效的抑制CTX对正常细胞带来的损伤作用。通过HL7702细胞进一步证实这一现象。本实验结果表明，含RGD的抗肿瘤活性肽T30肽在浓度达到40 μg/ml时，不仅可以增加CTX对肿瘤细胞的抗肿瘤作用，同时又能抵抗因使用 CTX对HL7702正常肝细胞损伤的保护作用。为今后相对降低CTX用药剂量，降低治疗成本，同时又能够降低用CTX带来的毒副作用，显示出良好的应用前景。

CTX是临床应用最普遍的光谱抗肿瘤化疗药物之一，T30肽在近年来也有大量文献报道其抗肿瘤作用，但未见其与化疗药物联合应用促进肿瘤细胞凋亡的同时对正常细胞的保护作用。为探求RGD-T30对于CTX损伤HL7702细胞保护作用的研究中，考虑到WST-1细胞增殖试验，这是一种检测细胞存活和生长的方法。WST-1是一种类似于噻唑蓝(MTT)的化合物，是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先WST-1和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-1性质比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。故实验结果更加精确可信。

在本研究发现在HL7702细胞培养液中分别加入CTX肽和不同的T30肽(0～100 μg/ml)培养24 h，细胞的增殖抑制在T30肽浓度达到20 μg/ml后得到改善，T30肽浓度达到40 μg/ml后具有明显的剂量依赖性，同样AO/EB双染实验和Annexin-V-FITC/PI流式细胞实验也支持这一实验结果。

在本研究中，首次发现含RGD序列的抗肿瘤多肽具有对CTX引起的正常细胞损伤的保护作用，但本结果仅提示含RGD抗肿瘤多肽全长具有此保护作用，因工作没有涉及不含RGD的多肽对CTX引起的正常细胞损伤是否同样具有此保护作用，所以还不能明确此保护作用完全来自于RGD序列。这也是进一步工作的研究方向。

1 Carini F，Saggese V，Porcaro G，et al.Surgical protocol in patients at risk for bisphosphonate osteonecrosis of the jaws:clinical use of serum telopetide CTX in preventive monitoring of surgical risk〔J〕.Ann Stomatol(Roma)，2012;3(1):31-6.

2 Wu M，Kelley MR，Kent Hansen W，et al.Reduction of BCNU toxicity to lung cells by high-level expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001;280(4):755-61.

3 Ragg S，Xu-Welliver M，Bailey J，et al.Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects mice against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of hematopoietic stem cells〔J〕.Cancer Res，2000;60(18):5187-95.

4 马培奇.细胞保护剂氨磷汀及其临床应用及展望〔J〕.中国肿瘤，2001;10(8):471-2.

5 Arap W，Pasqulini R，Ruoslahti E.Cancer treatment by targeted drug delivery to tumo vasculature in a mouse model〔J〕.Science，1988;279(5349):377-80.

6 Li S，Wei J，Yuan L，et al.RGD-modified endostatin peptide 30 derived from endostatin suppresses invasion and migration of HepG2 cells through the αvβ3 pathway〔J〕.Cancer Biother Radiopharm，2011;26(5):529-38.

7 Wu ZZ，Li P，Huang QP，et al.Inhibition of adhesion of hepatocellular carcinoma cells to basement membrane components by receptor competition with RGD-or YIGSR-containing synthetic peptides〔J〕.Biorheology，2003;40(4):489-502.

8 Stollman TH，Ruers TJ，Oyen WJ，et al.New targeted probes for radioimaging of angiogenesis〔J〕.Methods，2009;48(2):188-92.