原花青素对高脂血症模型大鼠脂肪因子及免疫调节的影响

邹金发 齐凤杰 董新茜 刘晓光 (辽宁医学院病理生理学教研室，辽宁 沈阳 121000)

高脂血症(HLP)是胰岛素抵抗(IR)、肥胖症、糖尿病、心脑血管病等疾病主要的危险因素〔1〕。脂肪组织不仅是体内主要的能量储存器官，而且是重要的内分泌器官，分泌多种细胞因子和炎症因子，如瘦素、脂联素(APN)、抵抗素以及肿瘤坏死因子－α(TNF－α)、白细胞介素－6(IL－6)等，其中 TNF－α 和 IL6 也是重要的免疫调节因子。这些因子均可以影响机体的代谢状态，从而影响IR的发生发展，而IR与肥胖、2型糖尿病、脂质代谢异常、心血管疾病的发生有密切的关系。原花青素(procyanidin)是一大类多酚类化合物的总称，具有广泛的药理活性，主要表现为抗氧化清除自由基、保护心血管和抗高血压、抗肿瘤、抗炎症〔2〕等作用。有研究报道，原花青素具有改善 IR的作用〔3〕。本课题拟探讨原花青素对HLP所致肥胖及IR作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂材料及仪器 甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL－C)、低密度脂蛋白(LDL－C)试剂盒购自南京建成生物制品研究所。大鼠血清胰岛素、瘦素、APN、抵抗素、TNF－α、IL－6放免试剂盒购自北京博奥森生物制品公司。SD雄性大鼠，SPF级，体重(250±10)g，由医学实验动物中心提供。全自动生化分析仪。

1.2 大鼠HLP模型的建立 40只SD雄性大鼠按照随机数字表法随机分为对照组(C)、HLP模型组(H)、原花青素高剂量组(HD)、原花青素低剂量组(LD)，每组10只。常规饲养1 w后，除对照组给予基础饲料喂养外，其余三组给予高脂饲料(基础饲料87.8%，猪油15%，胆固醇2%，胆酸钠0.2%)。动物室温度为20℃ ～23℃，相对湿度为40% ～60%，动物置正负压独立通风笼具(IVC)喂养，自由饮水与进食，每周称量体重并记录进食量。实验期为6 w。

1.3 给药方法 大鼠造模的同时，各组分别给予相应药物灌胃。根据预试结果确定原花青素高、低剂量组的给药剂量为200、100 mg·kg－1·b－1，对照组给予相应体积的生理盐水，连续6 w。

1.4 标本处理 大鼠灌药6 w后，禁食12 h，用10%水合氯醛0.1 ml/100 g麻醉，从腹主动脉取血，装入抗凝和不抗凝试管中，将不抗凝试管在4℃下3 000 r/min离心10 min，分离血清，待测相应指标。

1.5 指标的测定 采用酶法测定血清 TC、TG、LDL－C和HDL－C水平。血清胰岛素、瘦素、APN、抵抗素以及 TNF－α、IL－6水平测定按试剂盒说明书操作。

1.6 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行分析，实验数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法。

2 结果

2.1 原花青素对HLP大鼠体重的影响 实验期间(灌胃6 w)，大鼠的平均体重增长。1～4 w体重无明显变化，6 w后HLP各组大鼠的体重较对照组明显增加(P＜0.01)，而在使用高剂量的原花青素后，大鼠体重较H组减轻(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间体重变化(±s，g，n=10)

表1 各组大鼠不同时间体重变化(±s，g，n=10)

与C组比较:1)P＜0.01;与H组比较:2)P＜0.01

组别1 w 2 w 4 w 6 w C组 247.17±7.96 248.67±6.54 249.67±5.71 251.56 0.000 0.000 0.000 0.002±4.12 H组 250.72±9.95 253.32±6.93 255.42±6.34 257.86±2.671)LD组 245.53±4.09 246.03±3.37 249.43±4.11 254.63±4.27 HD组 244.80±9.07 244.90±6.87 246.90±6.87 253.63±2.312)F值 29.128 45.222 17.461 5.782 P值

2.2 原花青素对HLP大鼠血脂的影响 原花青素干预6 w后H组大鼠的血清TC、TG、LDL－C均较C组增高(P＜0.01或P＜0.05)，而HDL－C较对照组降低(P＜0.01);原花青素低剂量组、高剂量组 TG、TC、LDL－C水平较 H症组显著降低(P＜0.01);而低、高剂量组 HDL－C水平较 H组显著增高(P＜0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血脂含量(±s，mmol/L，n=10)

表2 各组大鼠血脂含量(±s，mmol/L，n=10)

与C组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与H组比较:3)P＜0.01

组别0.000 0.000 0.000 0.000 3.48±0.44 0.85±0.45 3.03±0.86 0.51±0.63 H组 4.05±0.132) 2.05±0.492) 2.73±0.212) 0.59±0.241)LD组 3.50±0.943)1.51±0.522)3)3.35±0.102)3)0.52±0.313)HD组 3.42±0.103)1.35±0.522)3)3.32±0.192)3)0.49±0.183)F值 93.448 704.52 34.164 12.206 P值TC TG HDL－C LDL－C C组

2.3 原花青素对HLP大鼠血清瘦素、抵抗素、APN及TNF－α、IL－6水平的影响 H组大鼠血胰岛素、Leptin、抵抗素水平均较C组显著增高，而APN水平较C组显著降低(P＜0.01);原花青素干预后，低剂量组、高剂量组的胰岛素、Leptin水平较H组降低(P＜0.01，P＜0.05);低剂量组的抵抗素水平较H组降低，但无统计学意义，高剂量组的抵抗素水平较H组降低(P＜0.05);高剂量组的APN水平明显增高(P＜0.01)。H组的血清 TNF－α、IL－6水平均较 C 组显著增高(P ＜0.01);给予干预后，低剂量组、高剂量组的血清TNF－α、IL－6水平均较H组显著降低(P＜0.01)。见表3，表4。

表3 各组血清胰岛素、瘦素、抵抗素、脂联素水平(±s，n=10)

表3 各组血清胰岛素、瘦素、抵抗素、脂联素水平(±s，n=10)

与C组比较:1)P＜0.01;与H组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05

组别 胰岛素Leptin(ng/ml)抵抗素(μg/L)APN(ng/L)42.13±1.81 0.64±0.33 8.99±0.97 6.00±0.24 H组 93.00±1.751) 1.11±0.601) 12.68±2.191) 5.52±0.301)LD组90.80±1.511)2) 0.81±0.541)3) 10.46±0.151) 5.94±0.51 HD组87.05±1.541)3) 0.76±0.371)3) 10.03±1.072) 6.15±0.223)F值 2 131.052 58.056 837.405 7.908 P值C组0.000 0.000 0.000 0.000

表4 各组血清TNF-α、IL-6水平比较(±s，n=10)

表4 各组血清TNF-α、IL-6水平比较(±s，n=10)

与C组比较:1)P＜0.01;与H组比较:2)P＜0.01

组别 TNF－α(ng/ml) IL－6(pg/ml)对照组207.448/0.000 23.553/0.000 0.65±0.58 15.02±0.32高脂血症组 0.91±0.591) 22.06±0.521)低剂量组 0.75±0.461)2) 19.02±0.361)2)高剂量组 0.64±0.502) 17.04±0.361)F/P值

3 讨论

HLP是由于脂肪代谢或运转障碍使TC、TG和(或)LDL－C过高和(或)HDL－C过低而引发的一种病症。HLP也是肥胖症和IR等疾病的主要的危险因素。高脂饮食可以使血脂含量增加，诱导HLP的发生。研究表明富含有脂肪的食物使动物饱腹感较差，并且高脂饮食使鼠肌肉解偶联蛋白3(UCP3)mRNA表达下调，使线粒体氧耗量减少，产热减少，脂肪量增加，最后导致肥胖〔4〕。

原花青素具有极强的抗氧化活性，是一种很好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂。本文观察到原花青素可显著降低高脂大鼠体重、血清TG、TC和LDL－C水平，并且高剂量组可以显著提高血清HDL－C水平，与一些研究报道〔5〕相符;并且原花青素干预后，HLP大鼠血清胰岛素水平降低。因此，推断原花青素的降脂作用对肥胖和IR有一定的预防和治疗作用。

高脂饮食可以引起脂肪组织增多，促进脂肪组织细胞因子分泌，如瘦素、抵抗素、APN，而后者又调节脂代谢及作用于胰岛素信号转录及的多个环节而导致IR〔6〕。瘦素来源于脂肪组织〔7〕，是调节脂肪和能量平衡重要的内分泌激素，研究发现大多数肥胖者体内瘦素水平增加，并且与BMI呈正相关〔8〕。瘦素能够抑制胰岛B细胞合成和胰岛素的分泌。高脂饮食引起脂肪堆积而使瘦素分泌增加，一方面，在长期高浓度瘦素的刺激下，胰岛B细胞的瘦素受体对瘦素不敏感，使瘦素对胰岛素合成、分泌的抑制作用下降，导致高胰岛素血症及IR;另一方面，高浓度瘦素可以下调葡萄糖转运子－4 mRNA和蛋白的表达，抑制葡萄糖摄取，减弱周围组织对葡萄糖敏感性，从而加重IR〔9〕。因此高水平的瘦素可能导致IR。本实验观察原花青素干预后，使HLP大鼠血瘦素水平明显降低，有利于瘦素正常生理功能的发挥，抑制食欲、减少能量摄入、增加能量消耗和降低体质量，并且调节糖代谢的平衡、促进脂肪分解和抑制脂肪合成、还调节免疫功能。

抵抗素也是由脂肪组织分泌的细胞因子，在机体生理代谢与调节中起重要作用，其在鼠和人类个体中广泛分布，具有诱导IR及调节炎性反应的作用。研究认为，抵抗素主要作用于脂肪细胞、肝脏、肌肉等胰岛素靶器官，抑制靶器官在胰岛素刺激下葡萄糖代谢，使周围组织对胰岛素的敏感性降低〔10〕。

APN是目前最明确和重要的一个具有抗IR作用的脂肪细胞因子，参与糖脂的代谢。实验证明，APN缺乏或APN基因破坏后，介导的胰岛素信号转导减弱，显示严重的IR;当APN分泌恢复正常后，上述现象及IR都可得到逆转。表明APN能增加胰岛素的敏感性〔11〕。本实验结果表明高脂饮食诱导6 w后大鼠血APN水平明显降低。进一步的研究表明〔12〕，APN刺激的葡萄糖利用和脂肪酸氧化可能是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径介导完成而达到抗IR的作用。

TNF－α、IL－6是由多种细胞分泌的一种细胞因子，可介导肿瘤细胞分解、细胞凋亡等，是重要的免疫调节因子，也是炎症免疫反应的重要介质。有研究显示，超重和肥胖者血清中IL－6水平增高〔13〕。本实验显示TNF－α与其他细胞因子在不同组织中直接或间接的作用引起IR:直接抑制葡萄转运蛋白4(GLUT4)蛋白的表达〔14〕;抑制脂蛋白脂酶活性，使血清FFA水平升高;诱导β细胞内一氧化氮合酶(NOS)的表达，使β细胞内NOS及一氧化氮(NO)增多(NO增多可抑制胰岛素信号和β细胞的功能);促进脂肪组织瘦素的产生及释放〔15〕。IL－6增加可抑制肝脏产生葡萄糖的能力，导致IR〔16〕;还可与leptin竞争相同的信号传导通路，导致leptin抵抗，使leptin对胰岛素分泌的抑制作用减弱，造成高胰岛素血症及 IR〔17〕;还有研究发现，IL－6增高会引起VLDL、TG增高〔18〕。故IL－6在肥胖和IR的发生发展中具有一定的作用。

本实验结果显示原花青素通过直接调节胰岛素水平及间接调节血清瘦素、抵抗素、APN、TNF－α和 IL－6水平的作用，在防治高脂血症诱导肥胖及IR的发生发展中发挥重要作用。

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