壳聚糖磷酯酰胆碱对AD大鼠海马中诱导型一氧化氮合酶和IκB激酶β表达的影响

郭 鹤 孟庆慧 汪娟娟 刘 敏 (潍坊医学院护理学院，山东 潍坊 261053)

阿尔茨海默病(AD)是常见的痴呆疾病，它是一种中枢神经系统退行性疾病，其病因和发病机制迄今仍不明确。所以尚缺乏有效针对性强的预防治疗措施。近期研究表明，脑内慢性炎症可能是AD的重要致病原因之一〔1〕，抗炎治疗是目前研究AD的热点问题之一。李秀艳等〔2〕研究指出壳聚糖磷脂胆碱复合物可提高AD大鼠脑内乙酰胆碱(ACh)含量，改善脑功能。本实验研究壳聚糖磷酯胆碱对AD大鼠的抗炎作用。采用大鼠双侧海马注射Aβ25～35制备AD炎性模型，观察壳聚糖磷酯胆碱对AD大鼠脑海马内炎性因子iNOS、IKKβ表达和AD大鼠的学习记忆能力。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠30只，清洁级，8月龄，体重(350±30)g(山东鲁抗医药股份有限公司实验动物部)。

1.2 主要药品与试剂 壳聚糖(青岛云宙生物科技有限公司，脱乙酰度97.5%);大豆卵磷脂(北京华清美恒天然产物技术开发有限公司，磷脂酰胆碱含量40%);Aβ25～35(美国 Sigma公司);iNOS和IKKβ抗体(美国Biowoild公司);PV法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.3 药物制备 准确称取室温下真空干燥的磷脂及β-环糊精各适量，溶于200 ml 1%壳聚糖乙酸溶液，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，将过滤后的溶液经蠕动泵导入Büchi290小型喷雾干燥器的双流向螺旋式喷嘴(直径0.7 mm)，根据实验设置控制气流量及进风温度，喷雾干燥“一步”制成粉末微球，得到壳聚糖磷脂酰胆碱超细粉末。分光光度法测定壳聚糖含量70.63%。

1.4 主要仪器 DMS-2 MORRIS水迷宫系统(中国医学科学院药物研究所);江湾-I型C脑立体定向仪(第二军医大学);DME型光学显微镜和超薄组织切片机(德国Leica公司)。

1.5 Aβ25～35的孵育 用无菌生理盐水将 Aβ25～35稀释成10 μg/μl。37℃孵育 7 d，使其变为凝聚态。

1.6 实验方法

1.6.1 动物分组及处理方法 30只Wistar大鼠随机化分组:对照组、AD模型组和壳聚糖磷酯酰胆碱药物组，各组10只。药物组和模型组双侧海马注射Aβ25～35;对照组经同样步骤注射0.9%生理盐水。药物组350 mg/kg灌胃，另两组0.9%生理盐水2 ml灌胃，共干预28 d。

1.6.2 AD模型制备 10%水合氯醛将模型组和药物组大鼠麻醉后，参照大鼠脑立体定位图谱，将头部固定于脑立体定位仪上，常规备皮消毒，切开，暴露前囟，牙科钻打孔后，将Aβ25～35悬浮液用微量注射器注入左右侧海马区各5 μl(前囟后3.5 mm，左右旁开2.5 mm，进针深3.0 mm)，缓慢注5 min，留针10 min，使其充分弥散，缓慢退针。消毒伤口，缝合，定期手术部位消毒。

1.6.3 Morris水迷宫观察 该实验检测大鼠学习记忆能力，每次6 d，共三次(造模前，造模7 d后，药物干预28 d后)，实验分两部分，5 d定位航行试验和1 d空间探索实验。5 d定位航行试验中，每天上午，下午各一次，分别将每只大鼠从四个象限面朝壁放入水中，记录寻找平台所用时间，既大鼠逃避潜伏期(EL)。如果大鼠2 min内未找到平台，将其牵引平台处停留10 s，EL计120 s。第六天空间探索实验，撤去平台，选第一象限入为水点将大鼠面朝壁放入，测其在2 min内跨过原平台位置次数和在原平台象限停留时间。

1.6.4 HE和免疫组织化学染色 10%水合氯醛将大鼠麻醉，0.9%生理盐水200 ml，4%多聚甲醛300～400 ml心脏灌注，然后断头取脑，4%多聚甲醛固定，冠状面切取脑海马注射点周围组织，经浸洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤后，每只大鼠随机取相同部位连续5张切片，进行常规HE染色和免疫组织化学染色检测。

2 结果

2.1 壳聚糖磷酯酰胆碱对大鼠学习记忆水平的影响 造模前，各组大鼠学习记忆水平比较没有差异(P＞0.05)。造模7 d后，模型组和药物组的学习记忆水平明显低于对照组(P＜0.05)，药物干预28 d后，模型组大鼠AEL明显延长、空间探索实验单位时间内跨越原平台次数和在原平台象限停留时间减少，与对照组有显著差异(P＜0.05)，和药物组也有显著统计学差异(P＜0.05)，每组两两比较结果见表1，表2。

2.2 HE观察结果 光镜下HE染色结果显示，对照组和药物组大鼠海马神经细胞排列规则整齐，细胞形态完整，但药物组有较少的坏死神经细胞(图1A，B)。模型组大鼠海马注射区周围可见海马神经细胞结构排列紊乱，局部神经元受损，小胶质细胞增生明显，胞核固缩，细胞染色变深(图1C)。

表1 各组大鼠水迷宫逃避潜伏期成绩(±s，n=10)

表1 各组大鼠水迷宫逃避潜伏期成绩(±s，n=10)

与对照组比较:1)P＜0.05;与药物组比较:2)P＜0.05

组别 造模前(s) 造模7 d后(s) 造模28 d后(s)对照组0.688 0.00 0.00 15.87±6.90 12.06±5.89 11.91±5.11模型组 15.38±8.14 25.33±13.631) 27.08±9.951)2)药物组 15.53±7.79 25.76±16.33 17.54±8.07 F值 0.374 89.235 222.387 P值

表2 各组大鼠空间探索实验成绩(±s，n=10)

表2 各组大鼠空间探索实验成绩(±s，n=10)

与模型组比较:1)P＜0.05

组别 跨越平台次数造模前 造模7 d后 造模28 d后平台象限停留时间(s)造模前 造模7 d后 造模28 d后对照组 6.05±1.54 7.25±2.79 8.05±2.161) 40.23±15.82 47.73±17.70 53.84±15.551)模型组 5.50±1.32 3.25±1.83 3.70±2.03 40.04±19.19 15.37±11.39 20.44±17.54药物组 5.75±1.33 3.40±1.64 6.00±2.221) 37.70±16.98 16.61±8.47 37.67±18.461)F值 0.774 22.343 20.673 0.132 39.199 18.801 P值0.466 0.00 0.00 0.877 0.00 0.00

2.3 免疫组织化学结果 图2可见，阳性细胞呈棕黄色，模型组海马CA1区可见iNOS和IKKβ大量表达(iNOS胞核、胞质均有表达，IKKβ胞质表达)。对照组阳性细胞表达很少，药物组阳性细胞表达介于二者之间，见表3。

图1 不同组海马C A1区HE染色的病理改变(HE，×400)

图2 不同组海马CA1区iNOS及IKKβ表达(DAB，×400)

表3 各组大鼠的iNOS和IKKβ阳性细胞表达数(±s，n=10)

表3 各组大鼠的iNOS和IKKβ阳性细胞表达数(±s，n=10)

与模型组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05

iNOS对照组 8.80±1.791) 9.02±2.381)组别 iKKβ 0.00 0.00模型组 41.40±4.17 38.20±2.38药物组 20.40±4.222) 19.80±4.602)F值 96.827 99.074 P值

3 讨论

Aβ异常沉积形成老年斑是AD典型病理特征。近年实验研究表明，炎症反应贯穿AD慢性病程的始终，胶质细胞活化是AD脑炎症反应的一个显著特征，它能诱导一系列炎症细胞活化，增殖〔3～5〕。激活的小胶质细胞存在很强的介导炎症反应作用同时还能上调炎症因子表达(如 TNF-α、IL-6、IL-1 等)〔6〕。本实验采用大鼠双侧海马立体定向注射Aβ25～35的方法建立A D动物模型，观察壳聚糖磷脂胆碱对在体条件下Aβ25～35诱导的小胶质细胞的活化及其分泌产物的影响。

IκB激酶是 NF-κB信号转导途径成员之一，IKKβ是 IκB激活作用的主要成分〔7〕。经典途径 IKKβ/NF-κB 激活 NF-κB，诱导炎症反应的表达与细胞凋亡〔8〕。IKKβ过表达或活性增加可以有效刺激炎症因子的生成，从而增加炎症反应〔9，10〕。Aβ能激活胶质细胞内的 NF-κB通路，促使炎症因子分泌iNOS〔11〕。iNOS是炎症中的一种反应性酶类，是胶质细胞增生表达与神经元损伤的标志。Capiralla等〔12〕研究通过抑制NF-κB转录和若干NF-κB 靶基因的表达，可抑制IKK/IκB/NF-κB通路，减轻AD脑炎症反应。因此，IKKβ和iNOS是炎症反应中的重要因子。用药物抑制IκB激酶激活作用，降低NF-κB的激活，可能起到抑制炎症因子IKKβ，iNOS的激活增生，从而抑制IKKβ/NF-κB通路，减轻AD脑炎症反应。本研究说明AD模型制备成功及药物壳聚糖磷脂胆碱有抑制海马部位炎症反应的作用。可能的机制是壳聚糖磷酯酰胆碱有一定的抑制或延迟IκB激酶激活，起到保护神经胶质细胞作用，降低了炎症因子激活增生，从而抑制或延迟了IKKβ/NF-κB通路的激活。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰化产物，具有良好的生物相容性，能打开细胞连接，可调节细胞的增殖、分化和细胞因子的产生，清除自由基，中和毒素，保护脑神经元和神经胶质细胞膜的作用，在活化神经细胞和抗衰老方面具有特殊功效，其抗炎作用可延迟并减轻AD的病理改变。机体服用磷脂后经转化，可增加ACh含量，直接被大脑利用。本实验将壳聚糖和磷脂采用喷雾干燥方法制备壳聚糖磷脂微球，提高其黏附性和降低清除率，可控制药物的释放，增加了药物生物利用度和亲水性药物通过上皮的渗透性。李秀艳等〔2〕研究指出壳聚糖磷脂胆碱复合物可能通过调节脑内乙酰胆碱代谢，提高AD大鼠脑内ACh含量，改善脑功能。本实验研究壳聚糖磷脂酰胆碱(壳聚糖∶磷脂∶环糊精=2∶1∶0.33)对AD大鼠的抗炎治疗作用。研究结果发现壳聚糖磷脂胆碱可以减少Aβ25～35诱导的AD炎性大鼠模型IKKβ和iNOS的阳性表达，能从行为学上改善AD大鼠的空间学习能力和认知能力。壳聚糖磷酯酰胆碱组比模型组大鼠找到平台时间明显缩短，单位时间内跨越原平台次数和在原平台象限停留时间较模型组明显提高。这说明壳聚糖磷酯酰胆碱具有一定对抗AD大鼠脑海马内炎症反应、抑制小胶质细胞增生及改善AD大鼠的学习记忆能力的作用。本实验属于小样本研究，其抗炎治疗作用及机制还有待进一步大样本研究。

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12 Capiralla H，Vingtdeux V，Zhao H，et al.Resveratrol mitigates lipopolysaccharide-and Aβ-mediated microglial inflammation by inhibiting the TLR4/NF-κB/STAT signaling cascade〔J〕.J Neurochem，2012;120(3):461-72.