带有Flag标签的ZNF580真核表达载体的构建及扩增

罗玉玉 赵 瑛 孔麟麟 张文成

(中国人民武装警察部队后勤学院生理学与病理生理学教研室，天津 300162)

人ZNF580基因是本课题组以致动脉粥样硬化因素-低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞，采用差异显示逆转录PCR技术分析得到的一个新基因(Genbank注册号:AF184939)。其cDNA编码的蛋白属于C2H2型锌指核转录因子家族的新成员〔1，2〕。前期研究显示:ZNF580在人体多种组织均有表达，可能是一种多信号响应的核转录因子，参与多种途径的细胞内信号转导过程〔3〕。为了深入研究ZNF580可能参与的信号转导通路，课题组应用酵母双杂交技术筛选了人胎脑cDNA文库，获得了可能与ZNF580存在相互作用的14种蛋白〔4〕。但由于酵母属于低等的真核生物，发生于其体内的蛋白间的相互作用，并不一定确实存在于高等的哺乳动物细胞中，因此我们还需要进一步在哺乳动物细胞内加以验证。本研究拟构建并扩增带有免疫标签的ZNF580真核表达载体，并应用于后续的哺乳动物细胞内免疫共沉淀实验。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒、细胞系 pCDEF Flag Vector购自上海睿星基因公司;pGB-ZNF580本室保存;E.coli DH5α感受态本室保存;HEK293细胞系本室保存。

1.2 主要试剂和试剂盒 T4 DNA连接酶、限制性内切酶SfiI购自Promega公司;细胞培养试剂、DNA纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自大连宝生物公司。

1.3 主要仪器和设备 Forma3111 CO2培养箱(美国forma公司);Scotsman AF 100制冰机(美国Bio-Rad公司);隔水式恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);SW-CJ-1F医用型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);高速低温离心机(美国Beckman公司);CK-40倒置相差显微镜(日本Olympus公司);超低温冰箱(日本Sanyo公司);凝胶成像分析系统(美国GelPro);超纯水系统(美国Minipore公司)。

1.4 酶切反应 将pGB-ZNF580及pCDEF-Flag质粒进行SfiI酶切。反应体系:SfiⅠ限制性内切酶0.5 μl;10倍缓冲液2 μl;100 × BSA 0.2 μl;质粒 17.3 μl，50℃，2 h。

1.5 纯化回收目的片段及连接反应 琼脂糖电泳后，切胶回收目的片段。具体步骤按试剂盒说明书进行。将回收的ZNF580片段亚克隆到pCDEF-Flag载体中，构建重组载体pCDEF-Flag-ZNF580。反应体系:T4 DNA连接酶1 μl;10×T4缓冲液1 μl;纯化的线状载体2.5 μl(100 ng);回收的ZNF580片段 5.5 μl(200 ng);共 10 μl混匀，16℃，连接过夜。

1.6 重组质粒转化细菌感受态 10 μl连接液全部加至含100 μl感受态细胞的离心管中，铺板前，3 000 r/min离心5 min，弃掉约150 μl上清，剩余液体重悬沉淀，全部铺于LB平板上，培养过夜。挑取单克隆，接种于LB液体培养基，摇床培养4～8 h。

1.7 重组质粒提取及鉴定 按试剂盒说明书提取质粒，酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，部分菌液送Takara公司测序鉴定。

2 结果

2.1 pGB-ZNF580酶切 pGB-ZNF580酶切结果见图1，在500 bp处可见ZNF580目的条带。

图1 pGB-ZNF580酶切

2.2 pCDEF-Flag质粒酶切 pCDEF-Flag质粒酶切结果见图2，两条条带分别为酶切前和酶切后。

图2 pCDEF-Flag质粒酶切

2.3 pCDEF-Flag-ZNF580重组质粒酶切 pCDEF-Flag-ZNF580重组质粒酶切结果见图3，在500 bp处可见ZNF580目的条带。

图3 pCDEF-Flag-ZNF580重组质粒酶切

2.4 pCDEF-Flag-ZNF580重组质粒测序 pCDEF-Flag-ZNF580重组质粒部分测序结果见图4，经分子生物学网站进行序列比对，重组质粒序列完全正确。

图4 pCDEF-Flag-ZNF580重组质粒测序

3 讨论

ZNF580是由本课题组首先克隆的一种可能与动脉粥样硬化发生、发展密切相关的锌指基因。其编码的蛋白属于一种新的C2H2型锌指核转录因子〔1～3〕。研究显示:C2H2型锌指核转录因子是真核细胞转录机制的重要参与者，其转录活性改变可影响其下游多种靶基因的表达，进而在细胞生命活动及疾病发生、发展中起重要作用〔5，6〕。传统认为，锌指结构的主要功能是作为DNA结合域，与靶基因富含G/C的顺式作用元件结合，识别靶基因调控区9个核苷酸组成的顺式作用元件。但越来越多的证据显示:锌指结构既可结合DNA，又可结合蛋白质。且在结合蛋白质方面，锌指结构具有更加重要而广泛的作用〔7〕。课题组前期为了寻找可能与转录因子ZNF580存在相互作用的蛋白，应用酵母双杂交技术筛选了人胎脑cDNA文库，获得了可能与ZNF580存在相互作用的14种蛋白〔4〕。这些蛋白中有一些是与基因的转录、翻译及调控转录、翻译过程有关的蛋白，还有一些是和细胞内信号转导有关或者和某些酶蛋白活性有关的蛋白分子，这与ZNF580本身作为转录因子的性质相吻合。

但到目前为止，还没有直接的证据证明ZNF580与它们之间的相互作用。酵母双杂交的结果仅仅是初步提出一个相互作用可能性，还需要进一步的实验来证实。因为蛋白质分子之间的相互作用是十分复杂的，时空特异性等方面的偏差会导致一些假阳性结果的出现。另外，酵母细胞是最简单的真核细胞，其体内蛋白质合成后加工修饰类型及其程度与哺乳动物的相应过程存在明显差别。因此，由酵母筛选出来的结果还必须在哺乳动物细胞中进一步严格验证。本实验所构建并扩增的带有免疫标签的真核表达载体pCDEF-Flag-ZNF580正是为后续进行哺乳动物细胞内的免疫共沉淀等验证性实验而设计。此重组表达载体构建的成功也为进一步研究ZNF580可能参与的细胞内信号转导通路，并最终揭示其功能奠定了基础。

1 张文成.血管内皮细胞中低密度脂蛋白及高密度脂蛋白反应性基因的克隆、鉴定与组织分布〔D〕.博士后出站工作报告.北京，2001.

2 张文成，陈保生，曾武威，等.低密度脂蛋白降调节新基因cDNA的克隆及结构分析〔J〕.中华医学杂志，2001;81(7):435-6.

3 张文成，陈保生，吴 刚，等.低密度脂蛋白诱导下调的新基因cDNA的克隆及组织表达〔J〕.基础医学与临床，2003;23(3):279-82.

4 Luo YY，Hu WL，Xu RCH，et al.ZNF580，a novel C2H2 zinc finger transcription factor，interacts with TGF-β signaling molecule SMAD2〔J〕.Cell Biol Int，2011;35(11):1153-7.

5 Wu LC.ZAS:C2H2 zinc finger proteins involved in growth and development〔J〕.Gene Expr，2002;10(4):137-52.

6 Iuchi S.Three classes of C2H2 zinc finger proteins〔J〕.Cell Mol Life Sci，2001;58(4):625-35.

7 Kathryn JB，David JS.Keep your fingers off my DNA:protein-protein interactions mediated by C2H2 zinc finger domains〔J〕.Cell Biochem Biophys，2008;50:111-31.