阿托伐他汀对人CD4+T淋巴细胞microRNA－21表达的影响

刘 洋 李 浪 周 游 王江友 苏 强 孙羽涵

(广西医科大学第一附属医院心内科，广西 南宁 530021)

他汀类药物是动脉粥样硬化性疾病的主要治疗药物，除明显改善血脂异常外，尚具有独立于降脂作用之外的多效性作用，其中抗炎特性最引人注目。研究表明，阿托伐他汀抑制CD4+T细胞的增殖，使 Th1分泌的细胞因子 IFN-γ、TNF-α减少，Th2分泌的细胞因子IL-4、IL-10分泌增多，从而调整Th1/Th2亚群平衡〔1，2〕。然而阿托伐他汀抑制CD4+T淋巴细胞炎症反应的具体机制尚未完全清楚。越来越多的研究表明，微小核糖核酸(microRNA)参与了免疫性疾病的发生发展。研究发现，在活化的CD4+T淋巴细胞中miRNA-21表达明显上调〔3〕，miRNA-21能够通过抑制靶蛋白程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的表达使IL-10分泌增多而起到抗炎作用〔4〕。本研究旨在了解阿托伐他汀对人CD4+T淋巴细胞miRNA-21表达的影响，从而进一步揭示他汀类药物的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 Dynabeads®FlowCompTMHuman CD4试剂盒购自 Dynal公司，RPMI1640培养基购自 Hyclone公司，TRNzol-A+总RNA提取试剂购自北京天根公司，逆转录试剂盒购自Fermentas公司，荧光定量试剂盒购自Rox公司，miRNAQ-PCR检测试剂盒购自GeneCopoeia公司，microRNA-21、U6引物由GeneCopoeia公司提供，PDCD4mRNA、GAPDHmRNA引物由上海生工公司合成，兔抗人PDCD4单抗购自Abcam公司，羊抗兔荧光二抗购自LI-COR公司，GAPDH单抗购自碧云天公司，人TNF-α ELISA试剂盒购自ebioscience公司，人IL-10超敏ELISA试剂盒购自Neobioscience公司。

1.2 细胞提取与分组 取12例健康志愿者新鲜外周血，按根据Ficoll-Paque密度梯度离心法提取PBMC细胞，重悬于1 ml 1640培养基，严格按照Dynabeads®FlowCompTMHuman CD4磁珠分选试剂盒说明书分选人CD4+T淋巴细胞。从分选出的细胞中取10 ml+90 ml PBS做细胞计数，同时用0.4%台盼蓝染色观察并计算出活细胞存活率。存活率＞90%的CD4+T淋巴细胞调整为1×106/ml，接种到6孔板中，每孔2 ml。分为①空白组:加等量1640培养基;②刺激组:加5 μg/mlPHA;③他汀药物干预组:分别加入不同浓度阿托伐他汀(终浓度为0、1、5、10 μmol/L)，先加PHA刺激1 h后再加阿托伐他汀。用含10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2 μmol/Lol/L的谷氨酰胺的改良型1640培养基，在5%CO2、37℃孵育48 h，分别离心取培养基上清和细胞用于后续实验。

1.3 实时荧光定量PCR检测各组细胞miRNA-21和PDCD4 mRNA的表达 按照Trizol操作说明提取细胞的总RNA，根据逆转录试剂盒合成cDNA。采用SYBR Green Ι荧光标记法检测PCR产物，总反应体系为20 μl，根据荧光定量PCR说明书分别加入不同组分，miRNA-21及内参U6引物由GeneCopeia公司提供(引物ID分别为:hsmq-0057和hsnRNAU6)，PDCD4引物:上游:5'-AACTGTGCCAACCAGTCCAA-3'，下 游:5'-TCTTCTCAAATGCCCTTTCATC-3';GAPDH引物:上游:5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游:5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。按试剂盒说明设置反应体系及参数，每个样本均做复孔检测，同时每次反应均设置阴性孔。结果采用2－ΔΔCT方法比较。

1.4 Western印迹检测各组PDCD4蛋白的表达 分选出的CD4+T淋巴细胞中加入100 μl蛋白裂解液混匀，然后在4℃下12 000 r/min离心20 min。提取上清转移至新离心管中，然后用BCA法检测蛋白浓度，内参为GAPDH。配置12%分离胶和5%浓缩胶，进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法转膜 40 min，用 TBST配置的 5%脱脂奶粉封闭 1 h，1∶2 500一抗4℃过夜，脱色摇床上用TBST洗膜5 min×5次，1∶5 000红外荧光二抗室温敷育2 h后双色红外激光成像系统扫描成像。

1.5 ELISA检测各组TNF-α和IL-10浓度 将收集的血清标本和ELISA试剂盒常温下放置约30 min，根据试剂盒说明书操作，于酶标仪下读取450 nm的OD值，根据标准曲线计算出样本的浓度。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件对数据做统计学分析。计量资料以±s表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。

2 结果

2.1 阿托伐他汀对miRNA-21和PDCD4 mRNA表达的影响①与空白组比较，PHA刺激组CD4+T淋巴细胞miRNA-21和PDCD4 mRNA相对表达量增加(P＜0.05);②与刺激组比较，加入阿托伐他汀干预后CD4+T淋巴细胞miRNA-21相对表达量进一步上调，且随着药物浓度增加，上调的程度越明显(P＜0.05);在阿托伐他汀浓度达10 μmol/L时miRNA-21相对表达量最高(P＜0.05);PDCD4 mRNA变化无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 不同浓度阿托伐他汀对CD4+T淋巴细胞miR-21及PDCD4 mRNA相对表达量水平的影响(±s)

表1 不同浓度阿托伐他汀对CD4+T淋巴细胞miR-21及PDCD4 mRNA相对表达量水平的影响(±s)

与空白组比较:1)P＜0.05;与PHA刺激组比较:2)P＜0.05

项目 空白组 PHA刺激组PHA+1 μmol/L 组PHA+5 μmol/L 组PHA+10 μmol/L 组miR-21 0.58±0.11 1.02±0.241)1.07±0.21 1.59±0.362)3.39±0.302)PDCD4 2.55±0.69 2.77±0.22 2.94±0.66 3.61±0.73 1.72±0.15

2.2 Western印迹检测PDCD4蛋白的相对表达量 ①与空白组(0.15±0.06)比较，PHA刺激组(0.43±0.04)CD4+T淋巴细胞PDCD4蛋白相对表达量明显增多(P＜0.05);②与刺激组比较，经阿托伐他汀干预后PDCD4蛋白相对表达量减少，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显，在阿托伐他汀浓度为10 μmol/L时抑制作用最显著(P ＜0.05)〔1 μmol/L他汀组、5 μmol/L他汀组、10 μmol/L 他汀组分别为(0.41 ± 0.07)，(0.26±0.10)，(0.19±0.03)〕，见图1。

图1 不同浓度阿托伐他汀对PDCD4蛋白相对表达量水平的影响

2.3 ELISA检测上清TNF-α和IL-10浓度 ①与空白组比较，PHA刺激组培养基上清TNF-α浓度明显增加(P＜0.05)，IL-10则无统计学意义(P＞0.05)。②与刺激组比较，加入阿托伐他汀后TNF-α浓度降低，且随着药物浓度的增加，变化越明显，在阿托伐他汀浓度为10 μmol/L时抑制作用最显著(P＜0.05)。③与刺激组比较，加入阿托伐他汀后IL-10的浓度增加，且随着药物浓度的增加，变化越明显，在阿托伐他汀浓度为10 um时促进作用最明显(P＜0.05)。见表3。

表2 不同浓度阿托伐他汀对培养基上清TNF-α和IL-10浓度的影响(±s，pg/ml)

表2 不同浓度阿托伐他汀对培养基上清TNF-α和IL-10浓度的影响(±s，pg/ml)

53.69±2.96 0.53±0.08 PHA刺激组 164.20±23.331) 0.61±0.26 PHA+1 μmol/L组 125.07±25.98 1.93±0.74 PHA+5 μmol/L组 89.12±13.362) 4.18±0.642)PHA+10 μmol/L 组 66.00 ±12.132) 6.86 ±0.672)IL-10空白组组别 TNF-α

3 讨论

他汀类药物己经广泛应用于冠心病的一级和二级预防。他汀类药物的临床益处除了降脂以外，还与能调节炎症、稳定斑块有关。他汀类药物能抑制CD4+T淋巴细胞的增殖起到抑制炎症反应的作用〔5〕。活化的辅助性T淋巴细胞(Th)根据分泌的细胞因子不同可分为两类:Th1细胞主要分泌 IFN-γ、TNF-α，Th2细胞主要分泌 IL-4、IL-10，Th2细胞分泌的抗炎因子能抑制Th1细胞分泌的促炎因子。正常情况下，Th1/Th2细胞趋于动态平衡，而冠状动脉粥样硬化主要是Th1细胞过度增殖导致Th1/Th2细胞失去平衡〔6〕。越来越多的研究发现，miRNA可以调节免疫反应。研究发现，miRNA-21在活化的CD4+T淋巴细胞表达上调〔3〕。在本实验中，PHA刺激后与空白组比较，CD4+T淋巴细胞miRNA-21表达上调。

据报道，过表达miRNA-21能够促进IL-10 mRNA表达增加110%，上清IL-10浓度增加85%〔7〕，抑制miRNA-21表达可使 TNF-α 表达增加〔8〕。Lu等〔9〕的研究发现，抑制 CD4+T 淋巴细胞miRNA-21表达能抑制Th2细胞极化，使CD4+T淋巴细胞分化偏向Th1，加重Th1介导的炎症反应，表明miRNA-21可以调控CD4+T淋巴细胞亚群Th1/Th2的平衡，从而使促炎-抑炎因子的分泌保持平衡。本实验发现，随着阿托伐他汀药物浓度的增加，CD4+T淋巴细胞miRNA-21表达量增加，培养基上清IL-10浓度增加，TNF-α浓度明显降低，提示阿托伐他汀能够调整Th1/Th2细胞分泌促炎因子和抗炎因子趋于平衡可能是通过调控miRNA-21起效。

PDCD4既往被认为是促炎因子，Anja等〔10〕研究显示，敲除小鼠PDCD4基因后，小鼠淋巴细胞分泌IL-10、IL-4抗炎因子明显增多，而IL-10能够抑制TNF-α分泌，表明PDCD4可能促进炎症发生。Merline〔11〕研究发现增加PDCD4表达，能够促进炎症信号的活化。本实验发现，与空白组相比，PHA刺激CD4+T淋巴细胞后PDCD4mRNA和PDCD4蛋白相对表达量均显著增加，培养基上清 TNF-α浓度也明显增多，提示 PDCD4参与CD4+T淋巴细胞的炎症反应过程。

既往研究证实，miRNA-21的靶基因之一是 PDCD4〔12〕，主要为转录后负调控蛋白的表达。Sheedy等〔4〕研究发现，过表达miR-21可以下调PDCD4，从而使抑炎因子IL-10表达增加，抑制促炎因子TNF-α表达，限制过度激活的炎症反应。本实验发现在不同浓度阿托伐他汀组中CD4+T淋巴细胞miRNA-21表达上调后，其靶蛋白PDCD4相对表达量显著减少，培养基上清的TNF-α浓度明显降低，IL-10浓度明显增加。提示miRNA-21可能通过抑制其靶蛋白PDCD4表达，促进抗炎因子IL-10的分泌，抑制TNF-α的表达，从而调控CD4+T淋巴细胞介导的炎症反应。

本研究亦发现，随着阿托伐他汀药物浓度的增加，CD4+T淋巴细胞miRNA-21相对表达量逐步上调，靶蛋白PDCD4相对表达量则逐步降低，促炎因子TNF-α浓度减少，抗炎因子IL-10浓度则增加，在药物浓度达10 μmol/L时作用最显著，表明阿托伐他汀调整CD4+T淋巴细胞抗炎因子和促炎因子平衡与促进CD4+T淋巴细胞miRNA-21的表达有关。

综上所述，阿托伐他汀能够促进miRNA-21表达增加，抑制其靶蛋白PDCD4表达，从而调控CD4+T淋巴细胞分泌抗炎因子与促炎因子平衡。可能是阿托伐他汀抑制CD4+T淋巴细胞炎症反应的机制之一。

本研究为他汀的抗炎作用提供了新的视角。然而本实验仅用了阿托伐他汀为实验用药，对于其他他汀类药物是否有同样作用尚需进一步研究。

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