Smad4、MMP－2在食管鳞癌中的表达及其与侵袭转移的关系

韩聚强 杨江霞 傅 天 李杰茹 李志丽 (河北医科大学西山校区生理教研室，河北 石家庄 050200)

食管癌主要死亡原因是术后转移。大量研究表明，食管癌的形成和转移是一个多基因、多因子共同作用的结果。本研究通过对食管癌组织中Smad4和MMP-2蛋白表达的检测，探讨Smad4和MMP-2表达与食管癌侵袭转移的关系及Smad4和MMP-2蛋白表达之间的相关性，为预测食管癌浸润转移提供客观参考指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选自河北医科大学第四医院2007年7月至2009年12月食管癌患者手术切除标本80例，其中男51例，女29例;年龄43～75岁，中位数年龄60岁;其中高分化鳞癌34例，中分化鳞癌22例，低分化鳞癌24例;有周围淋巴结转移者48例，无转移者32例。同时留取癌旁1～2 cm处不典型增生组织27例，取切缘正常黏膜组织12例作对照。患者术前均未进行任何抗癌治疗，所有患者均有完整临床病理资料，所有标本经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片备用。

1.2 免疫组织化学方法 采用SP方法，DAB染色，SP免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，鼠抗人MMP-2单克隆抗体购于北京中山生物技术有限公司，兔抗人Smad4多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。用已知阳性片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 免疫组化结果判断 MMP-2和Smad4在细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞，400×光学显微镜下每张切片至少计数10个视野，每个视野100个细胞，按阳性细胞所占百分比分为阳性或阴性，(-)无阳性细胞或阳性细胞＜5%，(+)阳性细胞＞5%。采用HPIAS-1000病理图文分析系统，将阳性切片上的阳性染色信号转化为灰度进行分析。选择每张免疫组化切片，用组织切片空白处入射光的值作为定标。每张切片测定6个高倍视野(10×40)中的每个阳性细胞的胞质或膜的灰度，取平均值作为测定值，最后以净灰度值为一张切片的终值，同时作为统计值。净灰度值=间质空白处灰度值-癌巢(或上皮)阳性细胞的灰度值。

2 结果

2.1 食管癌中MMP-2和Smad4蛋白表达 MMP-2在癌组织中的表达明显高于癌旁组织和切缘正常组织，Smad4在癌组织中的表达明显低于癌旁组织和切缘正常组织(均P＜0.01)，见表1。

2.2 MMP-2和Smad4蛋白表达与食管癌临床病理参数的关系 MMP-2和Smad4的表达量与食管癌患者的性别、年龄及癌组织分化程度均无关(P＞0.05)，而与癌组织浸润深度、淋巴结转移和临床分期等密切相关(P＜0.05)。见表2。

2.3 MMP-2与Smad4的相关分析 在食管癌组织中MMP-2的表达与Smad4的表达呈负相关(P＜0.05)。

表1 MMP-2和Smad4在食管上皮各种病变中的表达(±s)

表1 MMP-2和Smad4在食管上皮各种病变中的表达(±s)

与其他两组比较:1)P＜0.01

灰度值正常组织 12 01) 73.145±11.6631)组别 n MMP-2灰度值 Smad4癌旁不典型增生 27 41.574±9.2211) 56.784±14.5801)癌组织 80 64.151±10.6721) 33.360±10.6141)

表2 MMP-2和Smad4在食管癌中的表达

3 讨论

在肿瘤的发生和进展过程中，由于某些基因的异常表达及一系列的基因突变，使得一些肿瘤获得浸润及转移的特性，脱离原发瘤，穿透基底膜进入结缔组织，并侵袭淋巴管和血管等组织而发生转移。显然肿瘤转移需要通过细胞与细胞间质或与其他细胞的一系列相互作用而完成。

MMP-2是降解细胞外基质(ECM)和基底膜主要结构的关键酶，与多种恶性肿瘤的发展、侵袭、转移密切相关〔1，2〕。Li等〔3〕用免疫组化检测了MMP-2蛋白在58例食管癌中的表达，发现MMP-2蛋白的阳性表达与食管癌浸润深度、淋巴结转及淋巴结转移阶段呈正相关。本研究结果与Qi等〔4〕的研究结果相同，提示MMP-2参与食管癌的发生，作为食管癌发生的早期事件。本研究还发现，肿瘤细胞向深层侵袭和以后的转移与其分泌的MMP-2有关，MMP-2是食管癌侵袭和转移的一种促进因素。

Smad4基因是一种抑癌基因，其蛋白产物Smad4蛋白为传导TGF-β信号通路中一个关键的细胞内信使，将TGF-β信号从细胞膜传至细胞核。Smad4基因突变和缺失导致Smad4蛋白的异常表达，与胰腺癌〔5〕、直肠癌〔6〕胃癌〔7〕、肝癌〔8〕等恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关，与Smad4表达阴性者比较，Smad4表达阳性者肿瘤分化较好，生长速度较慢，侵袭和转移能力弱，预后较好。本研究与车启芬〔9〕、李昊等〔10〕的研究结果相同，提示Smad4蛋白表达缺失可能导致TGF-β信号途径的生长抑制效应的减弱或丧失并产生抗凋亡作用，从而具有选择性生长优势，导致食管癌发生。Smad4蛋白在临床分期ⅡB+Ⅲ期和有淋巴结转移的食管癌组织中的表达阳性明显低于临床分期Ⅰ+ⅡA期和无淋巴结转移的食管癌组织。食管癌组织中Smad4的表达缺失与肿瘤的浸润深度密切相关与Fukuchi等〔11〕报道一致。以上的结果说明，Smad4蛋白的表达缺失在食管癌的发展和侵袭转移中具有重要作用。

在恶性肿瘤发生机制的癌基因研究中，许多学者提出了基因协同作用假说，认为在恶性肿瘤发生发展和转移的各阶段，至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的基因各自发挥不同的作用，并在时间和空间上相互配合，协同细胞的癌变。本研究发现，MMP-2在食管癌组织中表达量明显高于癌旁不典型增生组织，同时Smad4蛋白在食管癌组织中表达量也明显低于癌旁不典型增生组织;Smad4蛋白表达量与MMP-2表达量在食管癌的浸润、淋巴结转移等方面呈显著负相关，表明Smad4蛋白与MMP-2在食管癌的系列病理过程(如癌的发生、侵袭及淋巴结转移)中，具有负调节的协同作用的可能。这可能是Smads基因突变或功能失活，导致TGF-β信号途径传导中断，产生的过多TGF-β作用于肿瘤细胞诱导表达血管内皮生长因子、MMP-2和MMP-9，负调控金属蛋白酶抑制因子，从而为蛋白酶提供丰富的微环境，有利于肿瘤细胞的迁移和浸润适当的血管上皮细胞，直接或间接地纵容了肿瘤细胞的转移。

1 Xiao CH，Feng YM，Li XQ，et al.Clinical significance and relationship of expression of matrix metalloproteinase-2 mRNA with breast cancer metastasis〔J〕.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2005;43(9):599-604.

2 Li BH，Zhao P，Liu SZ，et al.Matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metallo-proteinase-2 in colorectal carcinoma invasion and metastasis〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(20):3046-50.

3 Li Y，Ma J，Guo Q，et al.Overexpression of MMP-2 and MMP-9 in esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Dis Esophagus，2009;22(8):664-7.

4 Qi M，Li JS，Li Y，et al.Clinicopathological significance of expressions of RECK and MMP-2 in esophageal squamous carcinoma〔J〕.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2010;32(4):283-5.

5 Zhao S，Venkatasubbarao K，Lazor JW，et al.Inhibition of STAT3 Tyr705 phosphorylation by Smad4 suppresses transforming growth factor beta-mediated invasion and metastasis in pancreatic cancer cells〔J〕.Cancer Res，2008;68(11):4221-8.

6 Wang H，Rajan S，Liu G，et al.Transforming growth factor beta suppresses beta-catenin/Wnt signaling and stimulates an adhesion response in human colon carcinoma cells in a Smad4/DPC4 independent manner〔J〕.Cancer Lett，2008;264(2):281-7.

7 Barros R，Pereira B，Duluc I，et al.Key elements of the BMP/SMADpathway co-localize with CDX2 in intestinal metaplasia and regulate CDX2 expression in human gastric cell lines〔J〕.J Pathol，2008;5(4):411-20.

8 Huang S，Zhang F，Miao L，et al.Lentiviral-mediated Smad4 RNAi induced anti-proliferation by p16 up-regulation and apoptosis by caspase 3 down-regulation in hepatoma SMMC-7721 cells［J］.Oncol Rep，2008;20(5):1053-9.

9 车启芬，宋 阳，叶冬梅，等.Smad4在人食管癌中的表达〔J〕.解剖科学进展，2009;15(1):74-76.

10 李 昊，詹鹤琴，张洪福，等.SELIL和Smad4D蛋白表达与食管癌生物学行为的相关性研究〔J〕.临床消化病杂志，2007;19(3):157-62.

11 Fukuchi M，Nakajima M，Miyazaki T，et al.Lack of activated Smad2 in transforming growth factor-beta signaling is an unfavorable prognostic factor in patients with esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Surg Oncol，2006;94(1):51-6.